Erzeugung von Transgenics und Knockouts in Strongyloides-Spezies durch Mikroinjektion

Die Verwendung von Mikroinjektion, um DNA-Konstrukte in Strongyloides zu liefern, ermöglicht es uns, Knockouts und Transgene zu erzeugen, die verwendet werden können, um zu untersuchen, wie sich diese Würmer entwickeln, durch ihre Umgebung navigieren und Wirte parasitieren. Bisher ist dies die einzige erfolgreiche Technik zur Erzeugung von Knockouts und Transgenen in diesen Parasiten. Einen Tag vor der Mikroinjektion 180 Mikroliter der Agaroselösung mit einer Pasteur-Pipette aus Glas auf einen Deckzettel geben und dann sofort einen zweiten Deckscheine darauf fallen lassen, um die Agarose zu einem dünnen Pad zu glätten.

Entfernen Sie nach 5 bis 10 Sekunden den oberen Abdeckschlicker, indem Sie die beiden auseinander schieben und feststellen, auf welchem Schieber sich das Agar-Pad befindet, und legen Sie es mit der Vorderseite nach oben. Wählen Sie dann ein winziges Stück Glasscherbe aus einem zerbrochenen Deckblatt aus und drücken Sie es mit einer Pinzette vorsichtig in den Agar in der Nähe der oberen Kante des Pads. Am Tag der Mikroinjektion kleiden Sie den Baermann-Halter aus, bei dem es sich um ein Sieb aus zwei Kunststoffringen mit zwei Schichten Nylon-Tuile-Netz handelt, die zwischen ihnen mit drei überlappenden Laborgewebestücken befestigt sind.

Dann das Fäkalien-Holzkohle-Gemisch in den Baermann-Halter geben. Als nächstes legen Sie den Baermann-Halter mit dem Fäkal-Holzkohle-Gemisch in den Trichter, falten Sie die Gewebestücke um die Stuhl-Holzkohle-Mischung und fügen Sie genug Wasser hinzu, um den größten Teil der Fäkalienholzkohle zu tauchen. Bedecken Sie dann den Trichter mit einem 15 Zentimeter langen Kunststoff-Petrischalendeckel, um den Geruch einzudämmen, und beschriften Sie den Trichter nach Bedarf.

Halten Sie nach ein bis zwei Stunden ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen unter den Gummischlauch am Boden des Trichters und öffnen Sie vorsichtig die Klemmen an der Unterseite, um 30 bis 40 Milliliter wasserhaltige Würmer in das 50-Milliliter-Rohr zu geben. Dann. 15 Milliliter des Baermann-Wassers mit den Würmern in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Drehen Sie das Rohr, entfernen Sie bis zu 13 Milliliter des Überstands und entsorgen Sie es in einen flüssigen Abfallbehälter mit Jod, um Würmer abzutöten.

Nachdem Sie alle Würmer gesammelt haben, inspizieren Sie das Pellet der Würmer am Boden des Rohres. Wenn keine Würmer sichtbar sind, warten Sie ein bis zwei Stunden und sammeln Sie dann weitere Würmer aus dem Baermann-Apparat. Übertragen Sie die Würmer in so wenig Wasser wie möglich auf eine sechs Zentimeter große 2%-Nematoden-Wachstumsmediumplatte mit einem Rasen aus E.coli HB101 und verwenden Sie diese Platte als Quellplatte für die Mikroinjektion.

Bedecken Sie unter dem Seziermikroskop die Glasscherbe auf dem Mikroinjektionspad-Deckglas mit Halogenkohlenwasserstofföl mit einem Standard-Platinwurmpickel. Legen Sie dann den Abdeckschlupf des Mikroinjektionspads auf das Mikroinjektionsgerät und suchen Sie die mit Öl bedeckte Glasscherbe. Richten Sie die Glasscherbe so aus, dass eine Kante senkrecht zur Richtung der Nadel steht, um als Oberfläche zum Brechen der Nadel zu dienen.

Stellen Sie als Nächstes mit einem Seziermikroskop sicher, dass die Nadel keine Blasen oder Ablagerungen im sich verjüngenden Schaft aufweist, und befestigen Sie dann die Nadel 1 bis 1,5 Zentimeter in der Druckhalterung. Positionieren Sie die Nadelspitze mit dem Auge in der Mitte des Mikroskopfeldes und positionieren Sie die Nadelspitze unter geringer Vergrößerung im Sichtfeld senkrecht zur Seite des Glassplittens. Wechseln Sie dann zu einer höheren Vergrößerung und richten Sie die Nadelspitze mit dem Rand des Glases aus, in der Nähe, aber ohne es zu berühren.

Als nächstes, um die Spitze der Nadel zu brechen und den Flüssigkeitsfluss zu ermöglichen, klopfen Sie vorsichtig auf die Nadel an der Seite des Glasstücks, während Sie kontinuierlichen Druck aus dem Gas ausüben. Sobald die Flüssigkeit zu fließen beginnt, überprüfen Sie die Form der Spitze und stellen Sie sicher, dass sie bei leicht fließender Flüssigkeit scharf ist. Wenn die Flüssigkeit gut aus der Nadel fließt, bewegen Sie den Mikroinjektionsobjektträger zum Sezierbereich und fügen Sie ein bis zwei Mikroliter Halogenkohlenwasserstofföl auf das Agarpad für die Platzierung der Würmer hinzu.

Übertragen Sie 20 bis 30 junge erwachsene Strongyloides mindestens fünf Minuten lang ohne Bakterien auf eine 2%-Nematoden-Wachstumsmediumplatte, um überschüssige Oberflächenbakterien zu entfernen und einzelne Würmer für die Mikroinjektion auszuwählen. Fügen Sie während der Injektion nach Bedarf weitere Würmer auf die Platte ein. Wählen Sie mit einer kleinen Menge Halogenkohlenstofföl auf einem Wurmpickel ein Strongyloides-junges erwachsenes Weibchen mit ein bis vier Eiern in ihrer Gonade von der Platte ohne Bakterien aus und übertragen Sie den Wurm in einen winzigen Tropfen Öl auf dem Agarpad.

Positionieren Sie den Wurm vorsichtig mit dem Wurmwähler, so dass er nicht gewunden ist und die Gonade sichtbar und leicht zugänglich ist. Positionieren Sie dann den Wurm im Sichtfeld des Mikroinjektionsmikroskops und stellen Sie sicher, dass sich die Gonade auf der gleichen Seite wie die Nadel befindet und so positioniert ist, dass die Nadel die Gonade in einem leichten Winkel berührt. Als nächstes bringen Sie die Spitze der Nadel an die Seite des Wurms in der gleichen Fokusebene.

Dann zielen Sie auf den Gonadenarm in der Nähe der Mitte des Wurms und führen Sie die Nadel vorsichtig mit einem Mikroinjektor in die Gonade ein. Üben Sie sofort Druck auf die Nadel aus, um den gesamten Gonadenarm vorsichtig mit der DNA-Lösung zu füllen. Nachdem genügend Flüssigkeit injiziert wurde, entfernen Sie die Nadel und beobachten Sie, dass sich die Wunde schließt.

Wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Arm der Gona, wenn er sichtbar ist. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, überprüfen Sie schnell, ob die Nadel nicht verstopft ist, indem Sie Druck mit der Nadelspitze auf das Agar-Pad ausüben, und übertragen Sie dann den Objektträger mit dem injizierten Wurm auf das Seziermikroskop. Um den injizierten Wurm wiederherzustellen, legen Sie zuerst ein paar Tropfen wurmgepufferte Kochsalzlösung auf den Wurm, um ihn vom Agar-Pad zu schweben.

Sammeln Sie dann eine kleine Menge Bakterien auf einem Wurmpick und berühren Sie den Wurm mit den anhaftenden Bakterien, um ihn aus der Flüssigkeit zu entfernen. Übertragen Sie den Wurm vorsichtig auf die Rückgewinnungsplatte. Für Verhaltensexperimente übertragen Sie 20 bis 30 Larven auf eine 2% Nematoden-Wachstumsmediumplatte mit einem dicken HB101-Bakterienrasen und identifizieren Sie unter einem Fluoreszenz-Seziermikroskop die Larven, die das Transgen von Interesse ausdrücken.

Wählen Sie dann mit einem Wurmpickel die transgenen Larven aus und legen Sie sie in ein kleines Uhrenglas mit wurmgepufferter Kochsalzlösung. Für die Mikroskopie ritzen Sie mit einer Rasierklinge ein Gitter auf den Kunststoffboden einer 10 Zentimeter großen Chemotaxisplatte, um die Position der Würmer auf der Platte leicht zu verfolgen. Als nächstes fügen Sie drei Mikroliter Larven in wurmgepufferter Kochsalzlösung in ein Quadrat auf dem Gitter hinzu und füllen so viele Quadrate wie nötig.

Dann fügen Sie 15 bis 20-Mikroliter-Tropfen von 1% Nikotin in Wasser zu den Wurmtropfen hinzu. Nach vier Minuten, wenn die Würmer gelähmt sind, sieben Sie sie mit einem Fluoreszenz-Seziermikroskop ab. Transgene Strongyloides stercolaris-Larven mit einem unvollständigen und vollständigen act-2 mRFPmars-Expressionsmuster sind hier zu sehen.

Die lückenhafte Expression im Körperwandmuskel tritt häufiger auf, wenn das Transgen nicht in das Genom integriert ist. Im Gegensatz dazu deutet eine konsistente Expression im gesamten Körperwandmuskel oft darauf hin, dass sich das Transgen in das Genom integriert hat. Der wichtigste Schritt besteht darin, die Nadel in der gleichen Fokusebene wie die Gonade zu positionieren, um sicherzustellen, dass die DNA in die Gonade injiziert und in die sich entwickelnden Eier eingearbeitet wird.

Die Entwicklung dieser Technik ermöglichte es, die Genfunktion in parasitären Nematoden zu untersuchen, was neue Einblicke in die Mechanismen des Parasitismus und der Wirt-Parasiten-Interaktionen liefert.