Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo

Este protocolo demonstra um método simples de modificação genética in vitro para o estudo molecular da via de sinalização dependente do cítio primário nas culturas precursoras das células primárias do grânulo. Devido ao custo, baixa viabilidade e baixa eficiência do método de transfecção atual, introduzimos uma técnica de eletroporação simples, econômica e eficiente para investigar o caminho de sinalização dependente do cilium nas culturas primárias do GCP. Para começar, adicione 0,5 mililitros de cultura em cada poço da placa de cultura de 24 poços contendo deslizamentos de cobertura revestidos, e mantenha-o aquecido a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono.

Pipeta o número necessário de células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e gire a 200x G por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernatante e resuspenja a pelota celular em 200 microliters de Opti-MEM. Repita este procedimento duas vezes para garantir que nenhum meio de cultura residual esteja presente no tubo.

Defina os parâmetros de eletroporação conforme listado. Pipete a reação de eletroporação suavemente para misturar bem, e use uma longa ponta de pipeta P200 para transferir um volume exato de 100 microliters da mistura para o cuvette gap de dois milímetros. Uma vez que o cuvette esteja dentro da câmara de cuvette, pressione o botão ômega do eletroporador e observe o valor de impedância, aderindo a um volume preciso de 100 microliters.

A faixa de valor de impedância deve ser de aproximadamente 30 e 35. Pressione o botão de partida para iniciar o pulso. Registre os valores atuais medidos em Joules mostrados no quadro de leitura.

Retire o cuvette da câmara. Adicione imediatamente 100 microliters de meio de cultura pré-aquecido no cuvette e resuspended-lo por pipetting para cima e para baixo duas a três vezes. Transfira imediatamente a suspensão do celular para a placa de 24 poços previamente preparada.

Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Observe as células sob o microscópio de fluorescência no dia seguinte. No presente estudo, a eficiência de eletroporação dos grupos tratados com DMSO e SAG parecia comparável.

A imunossínia do marcador de cílio primário Arl13b demonstra que a taxa de ciliação de GCP em div-2 de cultura tanto no veículo quanto nos grupos tratados com SAG. A taxa de ciliação ilustra a porcentagem de Pax6 expressando GCPs com um cúrio primário na superfície celular na div-2 pós-eletroporação. A figura mostra um aumento significativo na localização de EGFP suavizada no axoneme de cílio primário das células GCP de expressão Pax6 em 24 horas após o tratamento SAG, indicando uma ativação profunda da via de sinalização de ouriço dependente de cílios primário.

Para obter uma maior eficiência de eletroporação, deve-se garantir alta pureza do plasmídeo utilizado, e nenhuma mídia de cultura de resíduos está presente na mistura de eletroporação plasmida. Este protocolo deve ser diretamente aplicável e benéfico para experimentos de modificação genética in vitro em culturas primárias e tipos de células difíceis de transfectar, incluindo neurônios e células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem.