Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo
30 de novembro de 2021
Aqui, apresentamos um protocolo de eletroporação in vitro reprodutível para manipulação genética de precursores primários de células de grânulo cerebelar (GCPs) que é econômico, eficiente e viável. Além disso, este protocolo também demonstra um método simples para o estudo molecular de vias primárias de sinalização de Ouriço dependentes de cílios em células GCP primárias.
Este protocolo demonstra um método simples de modificação genética in vitro para o estudo molecular da via de sinalização dependente do cítio primário nas culturas precursoras das células primárias do grânulo. Devido ao custo, baixa viabilidade e baixa eficiência do método de transfecção atual, introduzimos uma técnica de eletroporação simples, econômica e eficiente para investigar o caminho de sinalização dependente do cilium nas culturas primárias do GCP. Para começar, adicione 0,5 mililitros de cultura em cada poço da placa de cultura de 24 poços contendo deslizamentos de cobertura revestidos, e mantenha-o aquecido a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono.
Pipeta o número necessário de células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e gire a 200x G por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernatante e resuspenja a pelota celular em 200 microliters de Opti-MEM. Repita este procedimento duas vezes para garantir que nenhum meio de cultura residual esteja presente no tubo.
Defina os parâmetros de eletroporação conforme listado. Pipete a reação de eletroporação suavemente para misturar bem, e use uma longa ponta de pipeta P200 para transferir um volume exato de 100 microliters da mistura para o cuvette gap de dois milímetros. Uma vez que o cuvette esteja dentro da câmara de cuvette, pressione o botão ômega do eletroporador e observe o valor de impedância, aderindo a um volume preciso de 100 microliters.
A faixa de valor de impedância deve ser de aproximadamente 30 e 35. Pressione o botão de partida para iniciar o pulso. Registre os valores atuais medidos em Joules mostrados no quadro de leitura.
Retire o cuvette da câmara. Adicione imediatamente 100 microliters de meio de cultura pré-aquecido no cuvette e resuspended-lo por pipetting para cima e para baixo duas a três vezes. Transfira imediatamente a suspensão do celular para a placa de 24 poços previamente preparada.
Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Observe as células sob o microscópio de fluorescência no dia seguinte. No presente estudo, a eficiência de eletroporação dos grupos tratados com DMSO e SAG parecia comparável.
A imunossínia do marcador de cílio primário Arl13b demonstra que a taxa de ciliação de GCP em div-2 de cultura tanto no veículo quanto nos grupos tratados com SAG. A taxa de ciliação ilustra a porcentagem de Pax6 expressando GCPs com um cúrio primário na superfície celular na div-2 pós-eletroporação. A figura mostra um aumento significativo na localização de EGFP suavizada no axoneme de cílio primário das células GCP de expressão Pax6 em 24 horas após o tratamento SAG, indicando uma ativação profunda da via de sinalização de ouriço dependente de cílios primário.
Para obter uma maior eficiência de eletroporação, deve-se garantir alta pureza do plasmídeo utilizado, e nenhuma mídia de cultura de resíduos está presente na mistura de eletroporação plasmida. Este protocolo deve ser diretamente aplicável e benéfico para experimentos de modificação genética in vitro em culturas primárias e tipos de células difíceis de transfectar, incluindo neurônios e células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo reprodutível de eletroporação in vitro projetado para a manipulação genética de precursores de células granulares cerebelares primárias (GCPs). O foco está em um método que é ao mesmo tempo econômico e eficiente para o estudo das vias de sinalização Hedgehog dependentes do cílio primário.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Manipulação genética
- Sinalização celular
Contexto
- Os precursores primários de células granulares cerebelares (GCPs) são fundamentais para o estudo do desenvolvimento neural.
- Os métodos atuais de transfeção são frequentemente ineficientes e onerosos.
- O cílio primário é essencial para diversas vias de sinalização, incluindo a sinalização Hedgehog.
- A eletroporação oferece uma solução potencial para esses desafios.
Objetivo do Estudo
- Apresentar uma técnica eficiente de eletroporação para culturas de PGCs.
- Facilitar o estudo de sinalização dependente do cílio primário.
- Melhorar os resultados de manipulação genética em tipos celulares difíceis de transfectar.
Métodos Utilizados
- O experimento utilizou culturas in vitro de PGCs primárias.
- O protocolo de eletroporação envolveu parâmetros específicos para modificação genética eficaz.
- Nenhuma abordagem multiômica foi mencionada no estudo.
- Os passos críticos incluíram a ressuspensão celular e a sequência de eletroporação.
- A imunomarcação foi utilizada para avaliar as taxas de ciliogênese e a ativação da via de sinalização.
Resultados Principais
- O protocolo demonstrou um aumento significativo na ativação da via de sinalização Hedgehog em GCPs tratadas.
- A imunomarcação revelou um aumento notável na taxa de ciliogênese em GCPs após eletroporação.
- O estudo forneceu informações sobre a eficiência da eletroporação em comparação com métodos tradicionais.
- Concluiu-se que a alta pureza do plasmídeo é crucial para o sucesso da eletroporação.
Conclusões
- Este estudo apresenta um protocolo valioso para manipulação genética em GCPs primários.
- Os achados aprimoram a compreensão dos mecanismos de sinalização dependentes do cílio primário.
- Aplicações futuras podem incluir diversos tipos celulares difíceis de transfectar.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A manipulação genética eficiente de precursores de células granulares primárias (GCPs) é essencial para elucidar mecanismos de sinalização dependentes de cílios que sustentam vias neurodesenvolvimentais e de doenças. Este protocolo de eletroporação proporciona alta eficiência de transfeção e viabilidade celular, permitindo uma investigação robusta da dinâmica da via Hedgehog em sistemas relevantes para doenças. O método oferece confiança preditiva na descoberta inicial e na validação de alvos para moduladores de vias de sinalização.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação genética funcional da sinalização Hedgehog dependente de cílios em GCPs primários.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao permitir a visualização direta da localização de componentes da via.
- Facilita a validação de alvos por meio da manipulação reprodutível de nós de sinalização em células relevantes para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas de células primárias validados para triagem subsequente de moduladores de vias.
- Oferece alta eficiência de transfeção (~80-90%) e reprodutibilidade para resultados quantitativos de ensaios.
- Permite o desenvolvimento escalonável e economicamente viável de ensaios para modelos neuronais de difícil transfeção.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas in vitro com fenótipos celulares relevantes para a doença, garantindo continuidade translacional.
- Apoia a descoberta de biomarcadores ao permitir o rastreamento dinâmico da localização de proteínas sinalizadoras.
- Reduz o risco biológico no avanço pré-clínico ao fornecer dados mecanicistas robustos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se nas fases iniciais de descoberta e validação de alvos, conectando a manipulação genética à análise quantitativa de vias em sistemas neuronais primários.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a clarificação de vias em GCPs primários.
- Triagem: Fornece transfeção de alta eficiência e reprodutível para preparação de ensaios e leituras quantitativas.
- Análises: Permite a medição de taxas de ciliogênese e ativação de vias por meio de imunomarcação e microscopia de fluorescência.
- Pesquisa Translacional: Conecta insights mecanicistas in vitro a contextos celulares relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma amplamente aplicável para modificação genética em tipos celulares primários desafiadores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de vias.
- Valor Operacional: Padroniza a manipulação genética com alta reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao permitir dados robustos em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos e moduladores de vias de sinalização.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura primária de neurônios e técnicas de eletroporação.
- Exige acesso a equipamentos de eletroporação e microscopia de fluorescência para análise.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de pureza de plasmídeos e remoção de meio.
- Adaptável a outros tipos celulares primários de difícil transfeção, com otimização do protocolo.
- A eficiência depende do controle preciso dos parâmetros de eletroporação e da preparação da amostra.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Day In Vitro (DIV) 0: Electroporation for Overexpression of Hedgehog Receptor: pEGFP-Smo
2:28
Results: Assessment of Overexpression Efficiency and the Effects of SAG Treatment on Primary Cilium-Dependent Hedgehog Signaling Pathway
3:23
Conclusion
