Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular
10 de maio de 2022
O ensaio de cometa é um meio popular de detectar danos ao DNA. Este estudo descreve uma abordagem para a execução de lâminas em variantes representativas do ensaio do cometa. Essa abordagem aumentou significativamente o número de amostras, diminuindo o tempo de execução do ensaio, o número de manipulações de lâminas e o risco de danos aos géis.
O ensaio cometa é amplamente utilizado para avaliar a genotoxicidade. Nosso protocolo oferece uma série de vantagens metodológicas sobre o ensaio padrão de cometas. Nossa tecnologia se concentra em manter as lâminas de cometa padrão verticalmente e ser processada em lotes de 25 em um rack feito para esse fim.
Isso inclui eletroforese, de modo que o tanque é menor, usa menos tampão e tem resfriamento integrado. Sendo mantidos em um rack, os géis delicados nas lâminas são mais protegidos e passam de solução em solução em 25 segundos. Usando nosso protocolo de cometa de sangue, os pesquisadores podem usar uma picada de alfinete de sangue para estudar danos ao DNA em humanos, outras espécies e uma ampla variedade de exposições ambientais potencialmente genotóxicas.
Qualquer um dos diferentes formatos para o ensaio de cometa que usam lâminas de microscópio como suporte sólido para os géis do cometa são passíveis de nossa abordagem. A parte crucial desta técnica é o carregamento de amostras após a mistura com agarose LMP. As amostras devem ser carregadas rapidamente sem fazer bolhas e cobertas com um deslizamento de tampa imediatamente antes de solidificar.
Para começar, prepare a agarose de 0,6% de baixo ponto de fusão em PBS e coloque-a em banho-maria a 37 graus Celsius. Rotule a extremidade fosca das lâminas pré-revestidas com informações de nome, data e tratamento usando um marcador permanente ou lápis. Coloque uma placa de refrigeração em um banco plano e insira dois pacotes de resfriamento congelados na gaveta deslizante abaixo da superfície metálica.
Em seguida, coloque as lâminas na placa de refrigeração para pré-esfriar por um a dois minutos. Centrifugar e remover o sobrenadante dos tubos de amostra e colocá-los imediatamente de volta no gelo. Ressuspeite o pellet celular com 200 microlitros de agarose de 0,6% de baixo ponto de fusão e misture por pipetagem.
Em seguida, adicione 80 microlitros de células contendo agarose em uma lâmina resfriada e coloque rapidamente uma folha de cobertura no gel. Deixe o gel assentar na placa de arrefecimento durante um a dois minutos. Enquanto isso, prepare 500 mililitros de solução de trabalho de tampão de lise e despeje-o no prato de lise.
Depois que os géis se ajustarem, remova os deslizamentos da tampa rapidamente, segurando suavemente o deslizamento entre o polegar e o indicador e deslizando o deslizamento da tampa para fora do gel. Em seguida, coloque os slides dentro de um suporte de slide com todas as marcas de pontos pretas nos slides voltados para a mesma direção. Coloque o suporte deslizante dentro do prato de lise.
Feche a tampa do prato de lise e coloque-o para incubação. Retire cuidadosamente o suporte deslizante do prato de lise sem perturbar os géis. Coloque suavemente o suporte deslizante em uma máquina de lavar pré-carregada com água gelada de destilação dupla.
Certifique-se de que os slides estão completamente submersos e deixe a configuração por 30 minutos. Coloque um pacote de resfriamento congelado sob o tanque de eletroforese para manter a temperatura ideal do tampão. Em seguida, adicione a solução de trabalho de eletroforese gelada ao tanque e transfira o transportador de lâmina para ele.
Oriente as lâminas de modo que os géis contendo células apontem para o cátodo. Incube as lâminas no tanque de eletroforese por 20 minutos para permitir que o DNA se desenrole. Em seguida, ligue a fonte de alimentação para realizar eletroforese por 20 minutos a 1,19 volts por centímetro.
Após a conclusão da eletroforese, desligue a fonte de alimentação e remova o suporte deslizante do tanque de eletroforese. Deixe o suporte da lâmina escorrer em papel de seda por 30 segundos. Em seguida, coloque o suporte deslizante em um prato contendo tampão de neutralização e deixe-o por 20 minutos.
Em seguida, coloque-o em um prato de lavar roupa contendo água gelada de destilação dupla e deixe-o por 20 minutos. Após a lavagem, retire o transportador de lâminas da água e deixe as lâminas secarem em uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora. Para reidratar as lâminas, transfira o suporte de lâminas para um prato de lavagem contendo água gelada de destilação dupla e deixe-a por 30 minutos.
Em seguida, coloque o transportador deslizante em um prato de coloração contendo 2,5 microgramas por mililitro de solução de iodeto de propídio. Feche a tampa do prato de coloração e incube-o por 20 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após a incubação, transfira o transportador de lâminas para um prato separado e lave-o com água gelada de dupla destilação por 20 minutos.
Retire o suporte deslizante do prato e seque-o completamente no escuro, seja em uma incubadora de 37 graus Celsius ou à temperatura ambiente. Depois que os slides secarem completamente, armazene-os em uma caixa de slides no escuro até que estejam prontos para a análise da imagem. Os queratinócitos humanos foram irradiados com diferentes doses de UVA e UVB ou tratados com peróxido de hidrogênio 50 micromolares para induzir danos ao DNA.
A tensão ótima foi de 1,19 volts centímetros, pois induz a resposta mais sensível e a maior porcentagem de DNA da cauda. O sangue total humano foi irradiado com diferentes doses de UVA e tratado com diferentes concentrações de Fpg. O ensaio de cometa alcalino de alto rendimento revelou que os níveis ótimos de dano ao DNA foram induzidos com quatro unidades por mililitros de Fpg.
A linhagem celular de câncer de ovário SK-OV-3 foi tratada com uma combinação de cisplatina e peróxido de hidrogênio. As células não expostas não apresentaram danos. A exposição ao peróxido de hidrogênio por si só gerou um momento médio significativo da cauda de oliveira em comparação com as células nas quais as ligações cruzadas intrafilamentares de DNA foram induzidas.
Após o tratamento com cisplatina 100-micromolar, as ligações cruzadas intrafilamentares de DNA aumentaram com um pico em 12 horas, após o que os níveis diminuíram para zero após 30 horas É essencial colocar o bloco de gelo no tanque de eletroforese e incubar lâminas por 20 minutos para desenrolar o DNA antes da eletroforese. Este passo ajudará o DNA danificado a viajar pela corrente. Executar o ensaio com slides colocados verticalmente nos permitiu automatizar o ensaio do cometa.
Além disso, nossa técnica simplificou o ensaio de cometas para pesquisa.
Visão Geral
Este estudo apresenta uma abordagem avançada para o ensaio cometa, um método amplamente utilizado para detectar danos no DNA. Ao verticalizar as lâminas e processá-las em lotes, o método aumenta a produtividade das amostras, ao mesmo tempo que reduz o tempo e os riscos de manipulação.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Avaliação da genotoxicidade
- Detecção de danos no DNA
- Otimização do ensaio do cometa
Contexto
- O ensaio cometa é uma ferramenta fundamental na pesquisa genética.
- Os métodos convencionais podem ser demorados e intensivos em mão de obra.
- Melhorar o rendimento e minimizar danos ao gel é essencial para estudos eficazes.
Métodos Utilizados
- Protocolo modificado do ensaio cometa utilizando lâminas verticais.
- Aplicação a amostras de sangue humano e de outras espécies.
- Eletroforese com refrigeração integrada e uso otimizado de tampão.
Resultados Principais
- O novo método permite o processamento de 25 amostras simultaneamente.
- Proteção aprimorada dos géis durante a manipulação.
- Validado por meio de estudos sobre a resposta ao dano no DNA causado por exposições a UVA/UVB e agentes químicos.
Conclusões
- O estudo demonstra com sucesso uma abordagem simplificada do ensaio cometa.
- Os resultados contribuem para avanços na pesquisa e metodologia em genotoxicidade.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Plataformas de ensaio cometa de alto rendimento abordam um gargalo crítico na avaliação de genotoxicidade ao permitir a quantificação rápida e escalável de danos no DNA em diversos tipos celulares. Essa inovação aumenta a confiança preditiva nas fases iniciais de descoberta e triagem de toxicidade, apoiando decisões de portfólio ajustadas ao risco e a desconsideração de mecanismos de risco. Fluxos de trabalho simplificados e prontidão para automação posicionam essa abordagem como um ativo reutilizável para pipelines de P&D em escala corporativa.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite investigação robusta de vias de dano ao DNA para validação de alvos.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas ao quantificar respostas genotóxicas a compostos candidatos.
- Facilita a avaliação funcional dos mecanismos de reparo do DNA em sistemas relevantes para doenças.
- Aprimora a confiabilidade preditiva para triagem de ativos em estágios iniciais com base em perfis de genotoxicidade.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece quantificação padronizada e de alto rendimento de danos no DNA para triagem de compostos.
- Reduz a variabilidade do ensaio e o manuseio manual, favorecendo a reprodutibilidade e a escalabilidade.
- Permite avaliação rápida de múltiplas condições ou exposições em paralelo.
- Prepara sistemas biológicos validados para triagem mecanicista ou fenotípica subsequente.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha leituras de danos no DNA com estratégias de biomarcadores translacionais em modelos pré-clínicos.
- Apoia a continuidade da descoberta in vitro para a validação in vivo de efeitos genotóxicos.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a quantificação da cinética de reparo e dano do DNA.
- Fornece subsídios mecanicistas sobre a genotoxicidade induzida por compostos, relevante para a patogênese da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este ensaio cometa de alto rendimento integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico, permitindo a detecção precoce de riscos genotóxicos e apoiando a identificação e otimização de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Quantifica quebras de fita de DNA e ligações cruzadas para esclarecer mecanismos genotóxicos e riscos biológicos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para priorização de compostos e triagem de toxicidade.
- Análises: Gera medições padronizadas (por exemplo, momento da cauda de Olive, % de DNA na cauda) para comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos in vivo para alinhamento de biomarcadores e avaliação de risco.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma escalável e compatível com automação para testes repetidos de genotoxicidade em diversos programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na avaliação de genotoxicidade.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho, reduz o uso de reagentes e minimiza o manuseio manual de lâminas.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais rápidas de prosseguir/não prosseguir e melhora a eficiência do capital mediante a identificação precoce de riscos genotóxicos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos com perfis favoráveis de dano ao DNA.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na quantificação de danos ao DNA e na interpretação do ensaio de cometa.
- Necessita de suportes para lâminas especialmente projetados, refrigeração integrada e infraestrutura de eletroforese compatível.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de preparação e análise de amostras.
- Adaptável a diversos tipos celulares e condições de exposição, com controles validados.
- Depende de uma análise de imagens robusta e de avaliação estatística para resultados confiáveis.
