CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como usar o chip COMET para realizar medições de danos ao DNA de alto rendimento em células de mamíferos. Isso é feito primeiro carregando células de mamíferos no chip COMET. O segundo passo é tratar as células com produtos químicos que são conhecidos por causar danos ao DNA.

Em seguida, as células são lisadas e Electro East usando protocolos tradicionais de ensaio COMET. A etapa final é a imagem de fluorescência do DNA celular para visualizar a migração do DNA danificado. Em última análise, o software de análise de imagem é usado para quantificar a extensão do dano ao DNA.

Portanto, o ensaio com existe há muito tempo e é um ensaio muito útil para observar muitos tipos diferentes de danos ao DNA. Mas o problema é que é uma taxa de transferência muito baixa e falta sensibilidade. Então, criamos o chip COMET, que basicamente é uma versão de alto rendimento do ensaio COMET que torna possível fazer triagem de alto rendimento para triagem de drogas, por exemplo, e para estudos epidemiológicos.

O aluno de pós-graduação Jing GA em meu laboratório demonstrará o procedimento. O chip de coma é um gel com uma matriz de micro poços produzidos a partir de um micro selo fabricado com micro postes com diâmetros tão pequenos quanto os de uma única célula para começar a colocar em um filme de ligação de gel de placa retangular de um poço com o lado voltado para baixo. Depois de lavar o gel duas vezes em 25 mililitros em um XPBS, coloque o chip de vírgula em uma placa de vidro e, em seguida, rotule a orientação do gel de acordo.

Agora pressione suavemente uma placa invertida de 96 poços sem fundo no gel, garantindo que todos os 96 poços estejam dentro da área do gel. Em seguida, prenda ambos os lados da placa de 96 poços na placa de vidro com clipes de fichário de 1,5 polegada. Por fim, aspire qualquer excesso de PBS de cada um.

Colha bem as células em suspensão ou aderentes de acordo com os procedimentos padrão e dilua as células com meio até uma concentração final de 100.000 a 1 milhão de células por mililitro. Certifique-se de que uma única suspensão celular seja obtida passando por um filtro de célula, se necessário. Pipete 100 microlitros de suspensão celular em cada poço, a placa de 96 poços do chip cometa quando terminar.

Cubra a placa com o filme de ligação de gel para evitar a evaporação e, em seguida, coloque em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius por 30 minutos após remover a placa da incubadora. Quando os 30 minutos tiverem decorrido, aspire a mídia de cada um, em seguida, remova os clipes de fichário e a placa sem fundo de 96 poços Segure o chip de cometa com a placa de vidro em ângulo e enxágue suavemente com um XPBS para remover qualquer excesso de células em cima do aros. Agora veja a placa através de uma lente objetiva de quatro x em um microscópio de campo brilhante para verificar o carregamento ideal de células Depois que células suficientes forem carregadas, coloque um chip com uma superfície plana, uma sobreposição com 1% de baixo ponto de fusão agros que foi pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Deixe a cobertura solidificar à temperatura ambiente por três minutos e, em seguida, coloque-a a quatro graus Celsius por cinco minutos para que a dosagem completa seja dosada nas células com produtos químicos de interesse. Primeiro, alinhe cuidadosamente os poços do chip do cometa com os poços de uma nova placa de 96 poços sem fundo e pressione para baixo. Prenda a placa de 96 poços à placa de vidro com clipes de fichário como antes.

Em seguida, coloque a placa no gelo e adicione 100 microlitros do produto químico de interesse na dose desejada Para permitir que o produto químico sob investigação permaneça nas células com o período de tempo desejado após a dosagem, aspire a solução química de cada poço e enxágue com um XPBS, se necessário. Corte o gel em pedaços separados. Em seguida, para estudar a cinética de reparo, adicione meios de cultura aos poços incubados e prossiga para a lise celular em pontos de tempo específicos para células LY para o ensaio de cometa alcalino.

Prepare aproximadamente 25 mililitros de tampão de lise alcalina de trabalho para cada chip, adicionando 1% de Triton X 100 à solução estoque de lise alcalina. Em seguida, pré-resfrie a quatro graus Celsius. Transvase o tampão de lise alcalina em um recipiente um pouco maior que o chip do cometa.

Em seguida, mergulhe o chip alcalino no tampão de lise alcalino de trabalho resfriado, coloque na geladeira e deixe a lise prosseguir durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova o chip do cometa do tampão de lise e rapidamente rens com um XPBS. Em seguida, coloque o chip em uma câmara de eletroforese com o lado do filme de gel voltado para baixo e prenda com fita dupla-face.

Leve a câmara para a câmara fria de quatro graus Celsius e encha a câmara com tampão de eletroforese alcalina fria até um nível que cubra apenas o gel. Em seguida, deixe o chip a quatro graus Celsius por 40 minutos para permitir o desenrolamento alcalino. Finalmente, execute o gel a um volts por centímetro e 300 miliamperes por 30 minutos.

Na câmara fria, ajuste o volume do tampão de eletroforese na câmara para obter a corrente de funcionamento desejada. Para o ensaio de cometa neutro, faça um tampão de lise neutro de trabalho adicionando 1% de Triton X 110% de DMSO à solução de estoque de lise neutra. Novamente, preparando aproximadamente 25 mililitros de tampão de lise de trabalho para cada chip.

Coloque o tampão de lise neutro de trabalho na incubadora ajustado para 43 graus Celsius para pré-aquecer. Depois que o tampão de lise neutra for aquecido, mergulhe o chip de vírgula no tampão de lise neutra e coloque em uma incubadora de 40 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, remova o tampão de lise neutro e resolva duas vezes com tampão de eletroforese neutro por 15 minutos a quatro graus Celsius Cada vez, prenda o chip na câmara de eletroforese e transfira para a câmara fria.

Como antes, encha a câmara de eletroforese com tampão de eletroforese neutro frio até um nível que cubra apenas o gel e deixe o gel descansar em uma câmara fria por 60 minutos, execute o gel a 0,6 volts por centímetro e seis miliamperes por 60 minutos na câmara fria. Novamente, ajuste o volume do tampão de eletroforese na câmara para obter a corrente de funcionamento desejada, se necessário. Depois de remover o chip com da câmara fria, neutralize os géis lavando e neutralizando o tampão duas vezes por 15 minutos cada a quatro graus Celsius.

Fique no chip com uma coloração de DNA fluorescente, como ouro cyberg ou brometo de irídio. De acordo com as instruções do fabricante e a imagem usando microscopia fluorescente, os cometas Microwell representativos de TK não tratados, seis linfoblastos são mostrados no painel superior deste diagrama. As de seis células TK expostas a 50 peróxido de hidrogênio micromolar no painel do meio e 100 peróxido de hidrogênio micromolar no painel inferior.

Todas as exposições foram de 20 minutos a quatro graus Celsius. Este gráfico de linhas mostra a resposta à dose de peróxido de hidrogênio de seis células TK. Cada ponto de dados é a média de três experimentos independentes onde a porcentagem média de DNA da cauda de pelo menos 50 cometas individuais foi obtida em cada experimento.

Este gráfico mostra a variação de amostra para amostra do ensaio de chip de vírgula para TK seis células expostas a peróxido de hidrogênio por cento de dados de DNA de cauda de cada poço é mostrado aqui. Cada caixa representa a mediana de pelo menos 50 cometas individuais de cada poço. A média de 12 poços é de 77 vírgula 53%O desvio padrão é de 3,99%e o coeficiente de variação é de 5,2%Este gráfico mostra a variação de experimento para experimento.

A mesma exposição ao peróxido de hidrogênio foi repetida seis vezes, e os dados de cada repetição são mostrados como uma barra cinza. Cada caixa representa a porcentagem média de DNA da cauda de pelo menos 100 cometas individuais de cada repetição. A média de seis repetições é de 49,57% mostrada como a barra traseira aqui.

O desvio padrão de seis repetições é de 4,99% e a barra de erro da média é de 2,04% representada como a barra de ar na figura Como o ensaio comum tradicional. Os pesquisadores são livres para fazer modificações neste procedimento ou usar outras bagunças, como incluir enzimas específicas de lesões purificadas para responder a perguntas adicionais sobre o tipo de dano ao DNA produzido nas células. A técnica do chip do cometa abriu caminho para estudos de células de mamíferos para aprender sobre danos e reparos no DNA.

E por ser de alto rendimento, possibilita fazer estudos clínicos e epidemiológicos que antes não eram possíveis devido ao número de amostras.