Investigando Drivers de Anti-recompensa no Comportamento de Dependência com Métodos de Expressão Gênica de Célula Única Anatomicamente Específicos
4 de agosto de 2022
A combinação de microdissecção de captura a laser e RT-qPCR microfluídica fornece especificidade anatômica e biotécnica na medição do transcriptoma em neurônios únicos e glia. A aplicação de métodos criativos com a abordagem biológica de um sistema para doenças psiquiátricas pode levar a avanços na compreensão e tratamento, como a hipótese anti-recompensa da neuroinflamação no vício.
O protocolo é altamente sensível e permite a captura de alto rendimento do perfil de expressão gênica em resolução de célula única. A técnica fornece especificidade anatômica espacial e molecular em resolução de célula única. Depois de colher o cérebro, selecionar as células individuais e preparar o mRNA, injete fluido da linha de controle no chip qPCR para o priming.
Insira o chip qPCR no dispositivo de mistura microfluídica. Selecione o script Prime e execute o programa. Após a conclusão do programa, remova o chip qPCR preparado e pipete seis microlitros da reação da placa de amostra de PCR para o poço de amostra correspondente no chip de qPCR preparado.
Agora, pipete seis microlitros da reação da placa de ensaio de PCR para o ensaio correspondente bem no chip qPCR preparado. Em seguida, insira o chip no dispositivo de mistura microfluídica. Selecione o script Load Mix e execute o programa.
Ligue a plataforma microfluídica RT-qPCR e aqueça a lâmpada. Remova o chip qPCR do dispositivo de mistura microfluídica e retire o adesivo protetor da parte inferior do chip. Abra a plataforma microfluídica RT-qPCR e carregue o chip qPCR na plataforma.
Inicie o software de coleta de dados clicando em Iniciar uma nova execução. Verifique o código de barras do chip e o tipo de chip. Em seguida, clique em Avançar.
Selecione o arquivo de execução do chip e procure o local do arquivo para o armazenamento de coleta de dados. Em seguida, clique em Tipo de Aplicação e selecione Expressão Gênica. Selecione ROX para uma referência passiva, sonda única e EVAGreen para o tipo de sonda.
Clique para selecionar o programa de ciclo térmico e selecione Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2. pcl arquivo. Baixe o software de análise de dados.
Inicie o software para analisar o experimento microfluídico RT-qPCR. Clique em Chip Run e abra o ChipRun. bml que foi criado pelo experimentador.
Uma janela exibindo os detalhes experimentais, incluindo a referência passiva, a sonda e o programa térmico de PCR, aparecerá. Na guia Chip Explorer, clique em Configuração da placa de amostra e crie um novo modelo de placa de amostra. Copie e cole as etiquetas de amostra na planilha do software de acordo com o experimento.
Indicar o nome da amostra e a concentração de ARN utilizada para as amostras-padrão. Agora, mapeie a configuração de exemplo clicando em mapear no menu de tarefas e selecionando SBS96-Left.dsp. Em seguida, selecione Exibições de detalhes para atualizar essas alterações no arquivo e clique em Analisar.
Selecione Configuração da placa do detector e crie uma nova placa de ensaio. Selecione o tipo e o formato de contêiner apropriados. Cole os nomes dos ensaios de acordo com o experimento e clique em Analisar.
No painel de configurações de análise, clique em Usuário e defina o ajuste como automático. Agora, revise manualmente cada reação no chip 96x96. Visualize as curvas de amplificação e fusão para determinar se cada reação seguiu o padrão de qPCR esperado.
Se a amplificação ou a curva de fusão não corresponder ao esperado, falhe essa reação. Após o QC, exporte os dados selecionando o arquivo, clicando em exportar e salvando o conjunto de dados como um arquivo csv. Como o arquivo csv exportado tem uma matriz de falha de passagem e uma matriz com valores de CT brutos, use a matriz de falha de passagem para substituir todas as células com falha no conjunto de dados por NA. Baixe a versão recente do software R de código aberto e, em seguida, baixe o aplicativo R Studio.
Para a centralização da mediana, use o software R para calcular o valor mediano da TC calculado a partir de todos os valores da TC para uma amostra individual e, em seguida, subtraia todos os valores individuais da TC desse valor mediano para obter um valor de TC menos delta. Para a normalização do gene de limpeza, calcule a expressão média dos genes de limpeza para cada amostra e use esse valor para subtrair os valores individuais de TC. Para gerar um valor CT delta delta negativo, execute o código no software R.
Carregue o conjunto de dados normalizado em R e analise os dados usando a função de escala, gere os dados dimensionados e, em seguida, use a função de mapa de calor R ou o software separado para gerar um mapa de calor. Para organizar o conjunto de dados para outras funcionalidades, calcule as correlações de Pearson entre cada gene seguido pela função de fusão. Exporte e carregue esses dados em um software de rede de correlação gênica.
Os neurônios apresentaram expressão elevada de NeuN e as amostras microgliais apresentaram expressão significativa dos marcadores microgliais Cd34 e Cx3xr1. As amostras Th+neuronais demonstraram expressão significativamente elevada de Th em comparação com amostras Th-neuronais e microglia. Os neurônios-Th-exibiram expressão significativa de Gcg, sugerindo que as amostras Th-neuronais são enriquecidas com neurônios que usam Glp1 como neurotransmissor.
A análise discriminatória linear mostrou que esses três tipos de células tinham diferentes perfis de expressão gênica em todos os 65 genes. Os subfenótipos celulares de amostras de neurônios enriquecidos com Glp1 através de uma série temporal de abstinência alcoólica foram representados usando mapas de calor. O subfenótipo A, que expressa altamente o cluster de genes inflamatórios um, aumenta em proporção no ponto de tempo de retirada de oito horas e atinge um máximo de 32 horas de retirada.
O subfenótipo inflamatório é normalizado para controle por 176 horas de abstinência. O subfenótipo B, que expressa altamente o cluster de genes dois do receptor GABA, demonstra uma supressão geral na expressão desse cluster de genes pela condição de abstinência de 176 horas. A expressão gênica de amostras individuais foi combinada em médias para que a expressão de agrupamentos de genes e a localização proteica desse transcrito gênico pudessem ser visualizadas ao longo da série temporal.
Esta técnica pode ser aplicada a qualquer sistema biológico ou tecido para entender a resposta celular a uma doença ou perturbação. Trata-se de decifrar a resposta molecular em resolução de célula única relacionada à arquitetura espacial e anatômica do tecido.
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Visão Geral
Este estudo utiliza microdissecção a laser e RT-qPCR em microfluídica para analisar transcriptomas em neurônios e gliócitos individuais. Destaca a alta sensibilidade e especificidade do método, que pode aprimorar nossa compreensão de doenças psiquiátricas associadas à neuroinflamação, particularmente no contexto da dependência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise Transcricional
- Transtornos Psiquiátricos
Antecedentes
- Compreender os padrões de expressão de RNA em neurônios e células gliais é fundamental para elucidar doenças psiquiátricas.
- Métodos anteriores careciam de especificidade espacial anatômica e molecular.
- A neuroinflamação tem sido implicada na hipótese de anti-recompensa da dependência.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método sensível para capturar perfis de expressão gênica com resolução em nível de célula única.
- Analisar como essas alterações moleculares se relacionam com respostas comportamentais em condições psiquiátricas.
- Avaliar o papel da neuroinflamação nos mecanismos relacionados ao vício.
Métodos Utilizados
- Utilizou-se RT-qPCR em microfluídica, permitindo a coleta de dados em alto rendimento a partir de células individuais.
- Células individuais foram isoladas de tecido cerebral após a colheita, para preparação e análise de mRNA.
- Foram implementados protocolos detalhados para o condicionamento do chip, coleta de dados e análise.
- Os dados de expressão gênica foram validados e analisados usando software estatístico.
Resultados Principais
- Os neurônios exibiram expressão elevada de NeuN, enquanto as micróglias mostraram expressão significativa de Cd34 e Cx3xr1.
- Diferentes subtipos foram identificados com base nos perfis de expressão gênica, notadamente em resposta à abstinência e à neuroinflamação.
- Conclusões principais sobre aglomerados gênicos e sua regulação durante o estresse de abstinência foram obtidas a partir de análises de mapas de calor.
Conclusões
- O estudo demonstra que a combinação dessas metodologias permite uma compreensão mais rica das respostas específicas a tipos celulares na neuroinflamação.
- Os conhecimentos obtidos poderiam auxiliar no desenvolvimento de abordagens terapêuticas direcionadas para transtornos psiquiátricos envolvendo dependência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O perfilhamento da expressão gênica em nível de célula única com especificidade anatômica permite a redução de riscos mecanicistas na descoberta de alvos neuropsiquiátricos, especialmente para vias de adição e anti-recompensa. Essa abordagem fornece uma visão de alta resolução sobre os fatores desencadeantes da neuroinflamação, reforçando a confiança preditiva na interseção entre a patologia molecular e os fenótipos comportamentais. A integração desses métodos nos estágios iniciais dos processos de descoberta melhora a triagem de portfólios e a continuidade translacional no desenvolvimento de fármacos para o SNC.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses neuroinflamatórias e de antirecompensa com resolução em nível de única célula.
- Apoia a validação funcional de alvos ao associar a expressão gênica à especificidade anatômica e fenotípica.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas para alvos do SNC implicados em dependência e abstinência.
- Aprimora a confiança preditiva para o avanço de alvos neuropsiquiátricos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara sistemas celulares validados para triagem transcriptômica e fenotípica subsequente.
- Fornece saídas quantitativas e reprodutíveis de expressão gênica para padronização de ensaios.
- Permite análise de alto rendimento de redes gênicas em tipos celulares definidos.
- Apóia avaliação confiável dos efeitos de compostos em vias neuroinflamatórias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas moleculares com sistemas neuroanatômicos relevantes para doenças em modelos de dependência.
- Oferece continuidade do descobrimento à validação pré-clínica de biomarcadores neuroinflamatórios.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco para programas terapêuticos do SNC.
- Aprimora o desenvolvimento translacional de biomarcadores ao mapear a expressão gênica para fenótipos de abstinência.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método conecta a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica ao permitir análise de expressão gênica de alto rendimento e anatomicamente precisa em tecidos do SNC.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias relacionadas à neuroinflamação e mecanismos antirecompensa.
- Triagem: Fornece dados reprodutíveis e quantitativos de expressão gênica para o desenvolvimento de ensaios e triagem de compostos.
- Análise: Gera conjuntos de dados escalonáveis para análise de redes, mapas de calor e comparação estatística de fenótipos celulares.
- Pesquisa Translacional: Conecta assinaturas moleculares a estados de abstinência relevantes para doenças e alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para transcritômica de única célula em diversos modelos do SNC e de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos no sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Fornece fluxos de trabalho padronizados, escaláveis e reprodutíveis de expressão gênica em célula única.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital na pesquisa e desenvolvimento neuropsiquiátricos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de candidatos terapêuticos para o sistema nervoso central.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microdissecção a laser e plataformas de RT-qPCR em microfluídica.
- Requer infraestrutura analítica robusta para processamento de dados de alto rendimento e análise de redes.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de preparação de amostras e normalização de dados.
- Adaptável a diversos tecidos do SNC e modelos de doenças com otimização apropriada.
- Depende do acesso a instrumentação especializada e suporte em bioinformática.
