Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

O objetivo desta pesquisa é isolar células do tecido adiposo de forma eficiente e rápida. A digestão tradicional é um custo de tempo e pode ser excessivamente digerida. Nossa medição enzimática e mecânica oferece dispersão suave e reduz o tempo de isolamento.

Para começar, coloque um pedaço de tecido adiposo subcutâneo dorsal de um porco eutanasiado em um recipiente de cultura. Dissecar ao longo do plano natural entre o tecido adiposo e a derme para obter uma folha completa de ULB de dois a três milímetros de espessura. Enxágue o ULB uma vez em soro fisiológico gelado e estéril.

Após rasgar uma placa de cultura estéril, pese o tecido na placa estéril em uma balança pré-esterilizada. Para cada 1,8 grama de tecido, adicione 10 mililitros de tampão D-Hank's gelado e mantenha o tecido totalmente submerso. Use tesouras cirúrgicas estériles para identificar e retirar todos os vasos sanguíneos visíveis do tecido.

Remova qualquer tecido conjuntivo e componentes fibróticos. Descarte os materiais excisados em recipientes designados para riscos biológicos. Enxágue o tecido dentro do buffer de D-Hank para remover sangue residual e detritos.

Pese o tecido na placa de cultura estéril em uma balança pré-esterilizada após rasgar a placa. Transfira 1,8 grama dos fragmentos do tecido de enxaguamento para um tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro de cima. Adicione 800 microlitros de tampão de dissociação de tecido tipo A ao tubo.

Use tesouras oftálmicas estéreis para triturar o tecido do tubo em pedaços de aproximadamente um a dois milímetros cúbicos de tamanho. Transfira o tecido de carne moída junto com o tampão ao redor para um novo tubo microcentrífuga. Adicione 200 microlitros de agente dissociante de tecido tipo A ao tubo.

Gire e agite o tubo suavemente à mão três vezes para misturar o conteúdo. Certifique-se de que os fragmentos adiposos estejam totalmente imersos na solução de dissociação. Verifique se a tampa do tubo está bem fechada.

Coloque o tubo em um banho metálico a 37 graus Celsius e incube por cinco a dez minutos. Transfira o tecido adiposo parcialmente digerido em tampão para um tubo microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro designado para o sistema de dissociação mecânica. Execute o programa pré-definido para tecido adiposo realizar dissociação mecânica usando uma onda senoidal de 200 hertz.

Recolha a suspensão da célula e passe-a por um filtro de célula de 200 micrômetros até um novo tubo centrífugo de 50 mililitros. Adicione cinco mililitros de solução D-Hank pré-resfriada a quatro graus Celsius na peneira. Enxágue o penador duas vezes com a solução D-Hank.

Centrifuge a suspensão de célula filtrada a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Use uma pipeta pasteur estéril para aspirar e descartar a camada lipídica sobrenadante, deixando um mililitro de tampão para proteger a camada de adipócitos. Colete a segunda camada contendo os adipócitos sem perturbar a terceira e a quarta camadas.

Aspire e descarte a terceira camada. Adicione um mililitro de buffer de D.Hank ao pellet inferior contendo a fração vascular estromal, ou SVF. Ressuspenda suavemente o pellet celular no tampão para alcançar uma concentração celular de duas a cinco vezes 10, equivalente à potência de seis células por mililitro.

Prepare a suspensão da célula SVF em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Mantenha a suspensão no gelo até o uso. Adicione 10 microlitros da suspensão de célula SVF e 10 microlitros de solução azul de tripan 0,4% em um tubo microcentrífuga estéril de 0,5 mililitros.

Pipete suavemente para cima e para baixo três vezes. Transfira 10 microlitros da mistura de células coloridas para uma lâmina de contagem, apropriada para o contador automático de células. Verifique se a amostra preenche completamente a câmara sem transbordar.

Insira o slide de contagem no contador automático de células. Selecione o tipo de ensaio trypan blue e ajuste a faixa de concentração celular, se necessário. Pressione contagem para iniciar a contagem automática de células.

Monitore as imagens da câmara de contagem e observe a distinção automática entre células vivas e mortas. Registre a porcentagem de viabilidade das células e o número total de células viáveis exibidas na tela do instrumento. Realize três medições independentes para cada amostra.

Calcule a viabilidade média e o rendimento celular por grama de tecido adiposo. Prepare uma solução de coloração com cinco microgramas por mililitro descascado e um micromolar BODIPY em D.Hank's. Incube os adipócitos isolados na solução de coloração por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Use um sistema de vidro com cobertura de lâminas amigável a adipócitos feito por você para preparações adequadas à microscopia de fluorescência. O sistema de montagem caseiro amigável a adipócitos permitiu a distribuição uniforme dos adipócitos intactos para obtenção de imagens claras. Ao contrário dos métodos tradicionais que produziam arranjos apertados e em múltiplas camadas, os adipócitos extraídos apresentavam estrutura intacta e morfologia normal.

A taxa de sobrevivência dos adipócitos obtida pelo método de dissociação mecânica foi significativamente maior em comparação com o método tradicional de hidrólise enzimática. As células-tronco derivadas do adiposo, purificadas e cultivadas, apresentaram uma morfologia uniforme semelhante a fibroblasto, com células alongadas em formato de fuso dispostas de forma ordenada. A maioria das células permaneceu sem coração, indicando viabilidade, enquanto apenas uma pequena proporção se tingiu de azul, representando células mortas.

Esse protocolo permite que pesquisadores comparem os caracteres celulares isolados entre depósitos de adiposo. Os SVFs isolados do protocolo podem ser usados para construção de organoides e purificação de células-tronco adiposas. Estudos futuros podem otimizar ainda mais o método de isolamento, considerando as variações do tecido adiposo na matriz extracelular em todo o depósito.