Um Fluxo de Trabalho Modular para Análise Quantitativa, Estrutural e Funcional de Biofilmes de Leptospira

Estudamos biofilmes como estruturas protetoras que possibilitam a persistência ambiental e do hospedeiro, investigando a dinâmica da formação, composição molecular, características adaptativas e contribuição para a infecção. Combinando bioensaio cristalino, imagem por texto no tempo, microscopia confocal, microscopia eletrônica de varredura e transcriptômica em nossos laboratórios, avança a pesquisa em biofilmes por meio de análise multidimensional integrada. Para começar, cultive células de Leptospira em meio EMJH em tubos de vidro com tampa roscada de fundo plano.

Incube as culturas em condições aeróbicas a 30 graus Celsius sem agitar até que atinjam a fase logarítmica média. Garanta que as culturas atinjam uma densidade óptica entre 0,2 e 0,4 em 405 nanômetros, o que corresponde a dois a cinco vezes 10 à potência de oito células por mililitro. Usando um microscópio de campo escuro com ampliação de 20x, verifique se as células estão modais e não aglomeradas.

Diluir a cultura arrítmica arrítmica em dialogaritmia verificada em uma proporção de um para 100 em meio EMJH fresco para obter aproximadamente um por 10 até a potência de seis células por mililitro e misture suavemente por inversão, sem vórtice. Agora use pinças estériles para colocar uma membrana hidrofílica policarbonatosa estéril de 0,1 micrômetro plana no fundo de cada poço, em uma placa estéril de 24 poços com tampa. Adicione um mililitro de medium EMJH estéril a cada poço e pré-deixe a membrana de molho por duas horas a 30 graus Celsius.

Em seguida, remova a solução de imersão de cada poço sem deslocar a membrana e adicione 1,5 mililitro de suspensão bacteriana diluída, garantindo que a membrana permaneça firmemente no lugar no fundo. Depois, coloque uma bandeja cheia de água dentro da incubadora para manter a umidade. Incube a placa a 30 graus Celsius sob condições estáticas para permitir a formação de biofilmes.

Deixando a placa por até três semanas para cepas de crescimento lento. No momento desejado, aspire cuidadosamente o máximo possível de meio de cultura sem perturbar o biofilme. Enxágue cada poço suavemente com um mililitro de PBS estéril mantendo a membrana plana contra o fundo.

Adicione um mililitro de aldeído de paraforma a 4% em PBS em cada poço e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos para fixar as amostras do biofilme. Após a incubação, remova o fixador e enxágue suavemente duas vezes com um mililitro de PBS. Adicione um mililitro de solução de violeta cristalina de 0,1% de peso em volume a cada poço e incube em temperatura ambiente por 15 minutos, garantindo que o deslize de cobertura esteja totalmente submerso.

Depois, descarte o corante violeta cristalino de cada poço e enxágue duas vezes com um mililitro de PBS. Incline a placa e drene todo o líquido restante. Deixe a placa em temperatura ambiente para secar ao ar até que o substrato pareça completamente seco, de preferência durante a noite.

Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão eluciano composto por 50% de etanol e 50% de ácido acético glacial em volume em cada poço. Pipete para cima e para baixo para dissolver completamente a mancha presa ao biofilme. Agora, transfira 200 microlitros de cada amostra para uma microplaca opticamente clara de 96 poços.

Meça a absorção a 570 nanômetros e subtraia valores de fundo dos controles não inoculados processados em todas as etapas. Registre a média e o desvio padrão para pelo menos três réplicas técnicas. Obtenha os biofilmes em placas de poço, como demonstrado anteriormente.

Adicione uma solução de aldeído paraforma a 4% e glutaraldeído a 1% em tampão de sódio molar 0,2 a pH 7,4 nos poços. Incube as amostras fixas por 30 minutos a 37 graus Celsius. Remova o fixador e enxágue a amostra duas vezes com PBS para preservar o biofilme fixado à superfície, minimizando o descolamento.

Agora imerga o engobe de cobertura em tetróxido de 1% de ósmio diluído em PBS e incube por uma hora para aumentar o contraste da microscopia eletrônica de varredura. Depois, enxágue o substrato duas vezes com PBS. Desidrate as amostras mergulhando-as sequencialmente por 10 minutos cada em séries de etanol graduado.

Em seguida, adicione 500 microlitros de hexametildisilazano e incube por cinco minutos. Depois, substitua por hexametildisilazano fresco e incube por mais cinco minutos. Depois, remova o excesso de solução e deixe a amostra secar completamente ao ar livre sob uma exaustão de fumaça.

Agora monte as amostras secas em tocos de microscopia eletrônica de varredura usando fita de carbono condutiva dupla-face. Aplicar uma camada fina de aproximadamente 10 nanômetros de ouro ou platina nas amostras com sputter para aumentar o contraste eletrônico na imagem. Por fim, carregue os stubs preparados no microscópio eletrônico de varredura usando o suporte apropriado.

Evacue a câmara durante a noite, se possível, para melhorar a qualidade da imagem. Depois, adquira imagens secundárias de elétrons entre cinco e quinze quilovolts usando ampliações adequadas para visualizar a ultra estrutura do biofilme. Após 21 dias de incubação, a coloração em violeta cristalino revelou padrões visíveis de biofilme tanto em filtros de policarbonato quanto em lâminas de cobertura de vidro para Leptospira interrogans e Leptospira biflexa.

Cada espécie apresenta pegadas arquitetônicas distintas, como formas em pontos, ramificadas ou reticuladas. Medições de absorção a 570 nanômetros confirmaram maior retenção de violetas cristalinas em biofilmes de leptospira byflexa em comparação com interrogadores de leptospira em todos os pontos temporais, indicando maior acúmulo de biomassa na cepa. Microscopia eletrônica de varredura dos biofilmes de leptospira interrogans capturou depósitos iniciais de matriz extracelular em biofilmes de três dias de existência, uma face basal madura e canalizada com estrutura tridimensional aos 14 dias e consolidação matricial totalmente desenvolvida com arquitetura densa aos 21 dias.

Nosso protocolo otimizado sincroniza leituras complementares de culturas idênticas, aumentando a robustez, reduzindo a variabilidade e revelando informações dinâmicas e estruturais, disponíveis com abordagens de método único. Ao integrar análises complementares, nossos achados padronizaram a avaliação de biofilmes, esclarecendo a dinâmica e a arquitetura das leptospirosas. Eles vinculam a estrutura à virulência e fortalecem pesquisas comparativas reprodutíveis.

Futuros mutantes para relacionar a regulação com a morfologia e dinâmica do biofilme, esclarecer a persistência ambiental e avaliar estratégias que interrompam a informação do biofilme ou promovam a dispersão.