Name: Um Fluxo de Trabalho Modular para Análise Quantitativa, Estrutural e Funcional de Biofilmes de Leptospira (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a analisar biofilmes de Leptospira com ensaios de cristal violeta, microscopia confocal e eletrônica. Este protocolo modular padroniza a avaliação estrutural e funcional para pesquisa reprodutível em microbiologia.

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<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilm%3A+A+review+on+formation%2C+infection%2C+antibiotic+resistance%2C+control+measures%2C+and+innovative+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment.</a> Microorganisms. 11 (6), (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+An+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: An emergent form of bacterial life.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Mendhe, S., Badge, A., Ugemuge, S., Chandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+biofilms+on+chronic+infections+and+medical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges.</a> Cureus. 15 (11), e48204(2023).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sociobiology+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The sociobiology of biofilms.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).</li>
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<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish biofilm formation assay.</a> J Vis Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Beenken, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms.</a> J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).</li>
<li>Wilson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+assessment+methods+for+biofilm+growth%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Rev+J+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review.</a> Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).</li>
<li>Yildiz, F. H., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+biofilms%3A+So+much+the+same+yet+so+different%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio biofilms: So much the same yet so different.</a> Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+saprophytic+and+pathogenic+Leptospires%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires.</a> Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).</li>
<li>Chiani, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Leptospira+spp.+in+a+mosaic+of+wetlands+used+for+livestock+raising+under+differing+hydroclimatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).</li>
<li>Yamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+interactions+of+Leptospira+interrogans+with+proximal+renal+tubule+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells.</a> BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).</li>
<li>Santos, A. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+formation+in+Rattus+norvegicus+%28Norway+rats%29+natural+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs.</a> PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biofilm+formation+of+pathogenic+Leptospira+spp.+in+the+vitreous+humor+of+horses+with+recurrent+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis.</a> Microorganisms. 9 (9), (2021).</li>
<li>Dos Santos Ribeiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+biofilms+from+an+urban+community+in+Salvador%2C+Brazil%2C+shelter+previously+uncharacterized+saprophytic%C2%A0Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira.</a> Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogenic+leptospiral+protein+encoding+gene+%28lipL32%29+in+environmental+aquatic+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms.</a> Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospirosis%3A+Toward+a+better+understanding+of+the+environmental+lifestyle+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Water%22%5BJournal%5D)">Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira.</a> Front Water. 5, 1195094(2023).</li>
<li>Dias, C. S., Pinna, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+biofilms%3A+Implications+for+survival%2C+transmission%2C+and+disease+management%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management.</a> Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).</li>
<li>Gomes, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+production+of+Leptospira+spp.+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Sci+Vet%22%5BJournal%5D)">Biofilm production of Leptospira spp. strains.</a> Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).</li>
<li>Thibeaux, R., Kainiu, M., Goarant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+quantification+using+the+96-microtiter+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate.</a> Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Vimal Raj, R., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-existence+and+survival+of+pathogenic+Leptospires+by+formation+of+biofilm+with+Azospirillum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum.</a> FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).</li>
<li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Commun. 5, 4462(2014).</li>
<li>Rollet, C., Gal, L., Guzzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-detached+cells%2C+a+transition+from+a+sessile+to+a+planktonic+phenotype%3A+A+comparative+study+of+adhesion+and+physiological+characteristics+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).</li>
<li>Cagliero, J., Huet, K., Matsui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+golden+Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+leptospirosis-associated+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses.</a> Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).</li>
<li>Gomes-Solecki, M., Santecchia, I., Werts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+leptospirosis%3A+Of+mice+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters.</a> Front Immunol. 8, 58(2017).</li>
<li>Guedes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+enrichment+used+in+the+EMJH+medium+%28Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris%29+for+the+cultivation+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Argent+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp.</a> Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).</li>
<li>Iraola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+reveals+wide+expression+reprogramming+of+basal+and+unknown+genes+in+Leptospira+biflexa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms.</a> mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+transcriptome+highlights+adaption+to+starvation+and+general+stress+while+maintaining+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).</li>
<li>Thibeaux, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zoonotic+pathogen+Leptospira+interrogans+mitigates+environmental+stress+through+cyclic-di-GMP-controlled+biofilm+production%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).</li>
<li>Lawrence, J. R., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms.</a> Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).</li>
<li>Bridier, A., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+confocal+laser+scanning+microscopy+in+deciphering+biofilm+tridimensional+structure+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity.</a> Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).</li>
<li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+techniques+for+in+situ+analysis+of+the+biofilm+matrix+%28structure%2C+composition%2C+dynamics%29+by+means+of+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).</li>
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<li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+cells+for+SEM%2C+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane%3A+A+study+on+hepatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells.</a> J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1 & micro; Membrana hidrofílica policarbonata estéril m</td><td>it4ip</td><td>1000M25/861N101/13</td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de vidro estéril de 12 mm</td><td>SPL</td><td>330164</td><td></td></tr><tr><td>16% de paraformaldeído (PFA)&nbsp;</td><td>Termo Científica</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 21G</td><td>BD Medicina</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 24 poços</td><td>NUNC</td><td>143982</td><td></td></tr><tr><td>Prato de fundo de vidro de 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81218-200</td><td></td></tr><tr><td>Antena Hi-Q4 com fundo de vidro de 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 poços</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem antifade &nbsp;</td><td>Biorad</td><td>29410</td><td></td></tr><tr><td>Revestimentador de carbono</td><td>Leica Microsystem</td><td>Em ACE600</td><td></td></tr><tr><td>Rastreador CFDA/SE</td><td>Biolenda</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo condutor de carbono</td><td>Ciência da Microscopia Eletrônica</td><td>77816</td><td></td></tr><tr><td>Violeta cristalino (CV)</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de campo escuro</td><td>Leica Microsystem</td><td>11888846</td><td>Leica DM4000 B equipada com condensador fiel escuro (cat n&deg; 11505142)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>83813.36</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Supelco</td><td>1.00063</td><td></td></tr><tr><td>Solução de glutaraldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazano</td><td>Acros Organics</td><td>120581000</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Memmert</td><td>IN30</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal invertido</td><td>Leica Microsystem</td><td>Leica DMI6000 TCS SP8 X</td><td>Microscópio confocal SP8</td></tr><tr><td>Microscópio invertido equipado com óptica de contraste de fase</td><td>Nikon</td><td>CELL-S2</td><td>BioStation IM-Q</td></tr><tr><td>Leptospira Base Média EMJH&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD&nbsp; 279410</td><td>Médio EMJH para Leptospira</td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio (OsO4)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BCCG9181</td><td></td></tr><tr><td>Propídio iodeto &nbsp;</td><td>Biotium</td><td>40017</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT300</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de cacodilato de sódio &nbsp;</td><td>Termo-Química Científica</td><td>15453149</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Varioskan Lux</td><td>Termo Científica</td><td>VLBL00GD0</td><td></td></tr><tr><td>Soro salino tamponado com fosfato estéril</td><td>Biosolve</td><td>0016232301BS</td><td></td></tr><tr><td>Seringa (1 mL)</td><td>Chirana</td><td>CH03002L</td><td></td></tr><tr><td>SYTO9 coloração fluorescente verde de ácido nucleico &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr></tbody></table>

um fluxo de trabalho modular para análise quantitativa, estrutural e funcional de biofilmes de leptospira

A Modular Workflow for Quantitative, Structural and Functional Analysis of Leptospira Biofilms

Quando o inóculo é preparado corretamente, as culturas entram na fase média logarítmica em 3-5 dias e apresentam valores de OD405 de ~ 0,2-0,4, com campos brilhantes e altamente móveis sob microscopia de campo escuro (≥ 90% das células móveis) e sem aglomerados visíveis. Preparações subótimas apresentam-se como bactérias lentas e motilidade heterogênea em todo o campo; tais culturas frequentemente produzem biofilmes fracos e devem ser descartadas. Na prática, confirmar motilidade e OD lado a lado imediatamente antes da semeadura minimiza as tentativas falhadas. Estabelecer essas portas de controle de qualidade no estágio do inoculo é o melhor preditor de sucesso em aplicações posteriores. Embora a metodologia tenha sido otimizada para L. interrogans serovar Manilae L495, os mesmos procedimentos também foram aplicados à cepa Leptospira biflexa Patoc para demonstrar aplicabilidade entre espécies. L. biflexa geralmente forma biofilmes menos coesos e mais finos em comparação com L. interrogans, mas a sequência de desenvolvimento característica e as características estruturais permanecem detectáveis com ajustes apropriados dos parâmetros. Incluir ambas as espécies ressalta a adaptabilidade do fluxo de trabalho tanto para Leptospira patogênicos quanto saprófitos.
Após 21 dias de incubação estática a 30 °C em uma câmara umidificada (ou o tempo apropriado para as espécies de Leptospira usadas), os biofilmes tornam-se visíveis a olho nu tanto em cortinas de vidro quanto em membranas de policarbonato hidrofílico. Crescimento bem-sucedido produz padrões característicos de CV após 2-3 semanas, como pegadas pontuais, ramificadas ou reticuladas fixadas à superfície (Figura 2A).
Em uma execução típica, L . interrogans do tipo selvagem Manilae L495 atinge ~ 50% de cobertura superficial até a terceira semana, enquanto mutantes com baixo biofilme se estabilizam perto de ~ 20% e fenótipos de biofilme alto se aproximam de ~ 70-80%, estabelecendo uma faixa dinâmica prática para a triagem. A extensão da formação de biofilmes também pode variar dependendo da espécie e da cepa de Leptospira ; por exemplo, a cepa L. biflexa Patoc desenvolve biofilmes visíveis mais rapidamente, com estudos anteriores considerando estruturas já 120 horas após a inoculação como biofilmesmaduros 35.
A coloração de violeta cristalino fornece um método confiável e reprodutível para quantificar biomassa de biofilmes. Em biofilmes bem desenvolvidos, a coloração resulta em coloração roxa escura localizada na área do coverslide ou membrana, indicando altos níveis de biomassa aderida (Figura 2A). Pistas visuais durante as etapas de coloração e solubilização também fornecem indicadores úteis do sucesso do protocolo. Por exemplo, distribuição desigual do CV ou manchas pálidas podem ser causadas por subsemeadura, evaporação ou lavagem agressiva que desprenda biofilmes iniciais.
Leituras de absorção a 570 nm refletem a quantidade de corante retida e, portanto, a densidade relativa do biofilme (Figura 2B). Em experimentos representativos, culturas de L. interrogans cultivadas sob condições ideais apresentam leituras consistentes e reprodutíveis de OD₅₇₀ entre réplicas, refletindo a formação estável de biofilmes. Em contraste, grandes variações entre réplicas são frequentemente observadas quando amostras passam por pipeteamento excessivo durante mudanças de meio, indicando má adesão ou descolamento parcial de biofilme. Tal variabilidade deve ser considerada um sinal de problemas técnicos, e as amostras afetadas devem ser excluídas ou o protocolo cuidadosamente revisado. Notavelmente, L. biflexa Patoc forma biofilmes mais extensos tanto em coberturas de vidro quanto em membranas de policarbonato sob condições semelhantes, o que se reflete em valores de absorção CV mais altos, demonstrando que o protocolo é adaptável e eficaz entre espécies de Leptospira .
A preparação bem-sucedida do MEV consegue revelar depósitos de matriz extracelular já no terceiro dia, seguidos por uma arquitetura marcadamente polarizada em biofilmes maduros: uma face basal áspera e canalizada (frequentemente com &gt; canais de 5 μm) que ancora uma estrutura interna porosa, e uma face apical mais lisa onde as espiroquetas ficam entrelaçadas em uma matriz densa (Figura 2C, D, E, F). Campos de alta ampliação frequentemente capturam filamentos extracelulares ramificados e ocasionais protuberâncias semelhantes a cogumelos; características que correspondem à dinâmica de coalescência observada pelo time-lapse (Vídeo suplementar 1). Em preparações subótimas, matrizes colapsadas, carregamento e contornos indistintos das células podem ser observados, geralmente refletindo pós-fixação inadequada, revestimento condutor insuficiente ou secagem ruim. Quando a polaridade basal-apical e os canais pervasivos são evidentes, as leituras do MEV alinham-se de perto com as estimativas confocais de espessura e porosidade, confirmando a execução bem-sucedida tanto da preparação quanto da imagem.
Em séries efetivas de time-lapse, pontos isolados aparecem entre 24 e 72 horas e se agrupam progressivamente em agregados maiores que varrem a superfície antes que as limitações de espaço desacelerem seu movimento (Figura 3A, B, C). A segmentação quantitativa resulta em um aumento monótono na área total coberta, enquanto as contagens agregadas aumentam, atingem pico e depois diminuem à medida que colisões e fusões dominam entre ~12 e 216 horas. Essas cinéticas (área para cima, agregados para baixo) indicam acreção ativa em vez de simples sedimentação. Corridas fracassadas ou borderline carecem de pontos precoces, apresentam curvas de área planas ao longo do tempo ou sofrem desvio de foco ligado a temperatura/umidade instáveis. Manter um ambiente estabilizado de 30 °C com 95% de umidade e usar o autofoco em cada ponto de tempo normalmente restaura trajetórias claras adequadas para comparar mutantes ou tratamentos.
Os Z-stacks representativos de biofilmes maduros mostram arquitetura em forma de espuma, multicamadas, tipicamente superior a 50 μm de espessura, com a maioria das células colorindo vivas (SYTO 9-positivo) e ocasionais vazios centrais indicativos de rearranjos coletivos durante o crescimento (Figura 3D). Sondas matricial podem ser usadas para investigar a composição da matriz: a WGA destaca epítopos polissacarídeos, marcas BOBO-3 abundante DNA extracelular, e colorações seletivas para proteínas contribuem com pouco sinal externo ao sinal celular (Figura 3E). Resultados subótimos incluem empilhamentos finos ou descontínuos dominados por iodeto de propidium, fotobranqueamento forte ou configurações de ganho inconsistentes, cada uma das quais mina a comparabilidade quantitativa. Interpretar espessura, biovolume e razões viva/morto juntas (mantendo potência do laser, ganho do detector e orificio constante em todas as condições) confirma o status de maturação e apoia comparações diretas com ultraestrutura SEM e biomassa CV.
O processo de formação do biofilme de Leptospira normalmente segue fases distintas, embora os tempos e valores exatos possam variar dependendo da espécie ou cepa. Usando a cepa L. interrogans Manilae L495 como referência, a progressão esperada ao longo de 21 dias inclui uma fase inicial (dias 0-3) em que as bactérias permanecem majoritariamente plânctônicas com biofilme mínimo (Figura 4A). Isso é seguido por uma fase de crescimento exponencial (dias 3-7), durante a qual tanto as bactérias planctônicas quanto as associadas a biofilmes aumentam, atingindo cerca de 9 x 10⁸ células/mL, acompanhadas pela formação e expansão de agregados de biofilme. Entre os dias 7 e 12, as bactérias planctônicas diminuem significativamente, enquanto as células associadas a biofilmes atingem o pico, representando cerca de 80% da população. Finalmente, durante a fase de maturação (dias 12-21), o número de bactérias do biofilme diminui sem aumento das células planctônicas, mas o tamanho e a complexidade do biofilme continuam a crescer. Observar essa sequência de mudanças indica que o protocolo captura efetivamente o desenvolvimento dinâmico e a maturação dos biofilmes de Leptospira .
Quando realizado corretamente, o protocolo de infecção utiliza unóculos contendo ~2 x 10⁸ leptospias em 200 μL de EMJH, preparadas a partir de culturas planctônicas (5 dias) ou biofilmes bem definidas (21 dias). Embora esses dois tipos de cultura representem estados fisiológicos distintos, essa diferença é intencional, pois o experimento busca determinar se os biofilmes de Leptospira — caracterizados por atividade metabólica reduzida e diferenciação estrutural — mantêm a capacidade de iniciar infecção. Esse contraste é apoiado por estudos transcriptômicos que mostram grandes mudanças na expressão gênica entre o planctônico e o biofilme Leptospira 35,36. Agregados de biofilme são cuidadosamente colhidos para preservar sua estrutura e permanecem intactos após a passagem por uma agulha de 21 G, conforme confirmado antes da injeção (Figura 4C, D). Após a injeção intraperitoneal, hamsters dourados sírios normalmente apresentam sinais clínicos de leptospirose em 3 a 5 dias (por exemplo, letargia, pelo despenteado, prostração). Controles negativos injetados apenas com meio EMJH não apresentam sinais de doença. A progressão e a gravidade dos sinais clínicos, assim como o tempo até a eutanásia, variam de acordo com o inóculo: bactérias planctônicas frequentemente induzem sintomas mais precoces e agudos, enquanto agregados derivados de biofilme podem causar uma infecção retardada, porém persistente (Figura 4B). Monitorar duas vezes ao dia por até 21 dias permite registrar o curso completo da doença.
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Coloração de violeta cristalino, quantificação e imagem ultraestrutural de biofilmes de Leptospira. (A) Coloração de biofilmes cultivados em diferentes substratos com violeta cristalino (CV). A coloração CV permite a visualização da arquitetura do biofilme e dos padrões iniciais de fixação para diferentes espécies e substratos. i. L. interrogadores sobre filtro de policarbonato; ii. L. biflexa no filtro de policarbonato; iii. L. interrogadores em cobertura de vidro; iv. L. biflexa em cobertura de vidro. (B) Exemplo de formação quantitativa de biofilme avaliada pela absorvância CV (OD570 nm) ao longo do tempo para L. interrogans e L. biflexa. Essa leitura cinética captura tanto a adesão inicial quanto a dinâmica do acúmulo de biomassa, destacando diferenças no crescimento do biofilme entre espécies patogênicas e saprófitas. Esse número foi modificado emrelação a 27. (C-E) Microscopia eletrônica de varredura (SEM) dos biofilmes de L. interrogans: (c) biofilme de 3 dias mostrando formação inicial de microcolônias e deposição inicial da matriz extracelular; (d) biofilme de 14 dias exibindo arquitetura madura com organização matricial e tridimensional extensa; (e-f) Biofilme de 3 semanas ilustrando consolidação estrutural e maturação da matriz ao longo de cultivos prolongados. Essa combinação de coloração CV, medições quantitativas de OD e imagem SEM oferece uma visão abrangente do desenvolvimento do biofilme, desde a fixação precoce até a organização ultraestrutural madura, permitindo a comparação direta entre espécies e durações de cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Visualização da formação de biofilmes de Leptospira . Imagens de contraste de fase adquiridas com uma BioStation mostram o desenvolvimento do biofilme em (A) 48 horas, (B) 96 horas e (C) 144 horas. (D) reconstrução CLSM de um biofilme de Leptospira exibindo biovolume total com fatias ortogonais para visualização 3D. (E) Coloração confocal de um biofilme maduro com DAPI (verde) e WGA (vermelho), destacando células bacterianas e componentes da matriz extracelular. Esse número foi modificado emrelação a 37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Quantificação Resolvida no Tempo de Frações Planctônicas e Biofilmes e avaliação funcional de biofilmes de Leptospira . (A) Cinética da formação de biofilme medida pela absorvância a 405 nm. Para cada ponto de tempo, leituras foram feitas do poço total, da fração de biofilme e do sobrenadante contendo leptospias planctônicas, permitindo distinção entre bactérias aderidas e nadadoras livres. (B) Exemplos de curvas de sobrevivência de hamsters injetados com agregados de biofilme, leptospiros planctônicos ou controle EMJH. Animais injetados com biofilme apresentam virulência reduzida, com alguns sobrevivendo 21 dias, enquanto leptospias planctônicas causam mortalidade rápida. (C-D) Validação preliminar da integridade do biofilme: agregados são visíveis na seringa antes da injeção (C) e permanecem intactos após a passagem por uma agulha de 21 G (D, setas brancas), confirmando que a estrutura do biofilme é preservada durante o manuseio. Esse número foi modificado emrelação a 36. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>

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