Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão

As células-tronco têm o notável potencial de se desenvolver em muitos tipos diferentes de células no corpo. Servindo como uma espécie de sistema de reparo para o corpo. Eles podem teoricamente se dividir sem limite para reabastecer outras células.

Quando uma célula-tronco se divide, cada nova célula tem o potencial de permanecer uma célula-tronco ou se tornar outro tipo de célula com uma função mais especializada. Esta área promissora da ciência está levando os cientistas a investigar a possibilidade de terapias baseadas em células para tratar doenças in vitro. A diferenciação de células-tronco embrionárias ocorre quando as células podem se agregar em cultura em suspensão.

Na ausência de embriões de camundongos, alimentadores de fibroblastos e fator inibidor da leucemia, esses agregados celulares são chamados de corpos embrionários. O método da gota suspensa é um procedimento eficaz para a diferenciação de células-tronco em corpos embrionários in vitro. Olá, sou Sha Juan, da divisão de Medicina Cardiovascular da Universidade de Stanford.

Hoje mostraremos um procedimento para diferenciação individual de células-tronco embrionárias para empirar o corpo usando o método de gota manual. Normalmente, usamos esse método para diferenciar células-tronco embrionárias em cardiomiócitos. Este procedimento, incluindo as seguintes etapas, preparando uma suspensão de célula única de células-tronco embrionárias, gerando culturas de gotas manuais, transferindo culturas de gotas manuais para placas de fixação ultrabaixa e os corpos bordados de revestimento em placas revestidas com saliência.

Ok, vamos começar. O primeiro passo do procedimento é preparar uma suspensão unicelular de células-tronco embrionárias. Como cultivamos nossas células-tronco embrionárias indiferenciadas cultivando-as em fibroblastos embrionários de camundongos, devemos separar as células e separá-las dos fibroblastos.

Para fazer isso, analisamos as células usando procedimentos padrão. Assim que a tentativa e o tratamento estiverem concluídos, adicione meio de células-tronco embrionárias de camundongo para neutralizar a tripsina. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mil.

Em seguida, quebre as colônias de células pipetando para cima e para baixo contra o fundo do tubo até obter uma suspensão fina de células sem aglomerados visíveis. Agora gire as células a mil RPMs por cinco minutos. Depois de girar, as células aspiram do supernat e ressuspendem as células com 10 mils de célula ES de camundongo. Média.

Transferir a suspensão celular para um balão T 75 pré-codificado com gelatina a 0,1% e incubar a 37 graus com 5% de CO2 durante uma hora. Após uma hora, os fibroblastos se fixaram na placa, mas as células-tronco permanecem no meio. Pipete o meio para coletar as células-tronco.

Gire as células a mil RPMs por cinco minutos e aspire o meio. Em seguida, adicione mais 10 mils de meio de diferenciação e ressuspenda as células por pipetagem repetitiva até que pareça haver uma fina suspensão de células. Conte as células usando um hemocitômetro.

Agora estamos prontos para cultivar a suspensão celular usando o método de gota suspensa. Para iniciar a cultura de gotas suspensas, use a mediana de diferenciação para diluir a suspensão de células-tronco a uma concentração de 500 células por 20 microlitros. Em seguida, inverta uma tampa de placa de cultura de tecidos de 150 milímetros.

Em seguida, pipete 20 microlitros da suspensão celular na superfície interna da tampa da placa. Usando um pipetador multicanal, adicione 10 mils de PBS na placa. Inverta rapidamente a tampa da placa e coloque-a suavemente na placa para formar as gotas suspensas.

Assim que a tampa da placa estiver no lugar, transfira cuidadosamente a placa para a cultura da incubadora. As celas não foram perturbadas por dois dias. Assim que a incubação estiver concluída, prosseguiremos com a transferência da cultura de gotas suspensas para placas de fixação ultrabaixas.

Após dois dias, vire cuidadosamente a tampa da placa em seguida, aspire 180 microlitros de meio de diferenciação fresco e coloque várias gotas em uma placa de fixação ultrabaixa de 96 poços. Em seguida, pegue as gotas com uma pipeta e transfira-as uma a uma para a placa de 96 poços. Coloque as placas na incubadora sem perturbações por três dias.

Os corpos embrionários continuarão crescendo em forma de bola. Quando a incubação estiver completa, estaremos prontos para plaquear os corpos embrionários. A fim de ajudar os corpos embrionários a continuar a se diferenciar.

Nós os transferimos para uma placa revestida de gelatina de 48 poços. Para fazer isso, primeiro revestimos cada poço da placa com 300 microlitros de gelatina a 0,1%. Depois de adicionar a gelatina, incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, aspire a gelatina da placa de 48 poços. Em seguida, adicione 300 microlitros de meio de diferenciação a cada um. Bem, agora, um por um, transfira os corpos embrionários dos 96 poços para as 48 placas revestidas de gelatina do poço.

Costumamos mudar o meio no dia seguinte e depois em dias alternados para manter as células. Usamos esse método para procurar melhores protocolos para diferenciar células-tronco embrionárias. Nos cardiomiócitos, acabamos de mostrar como realizar a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos usando culturas de gotas suspensas.

Este método é eficaz porque o fundo redondo da gota suspensa permite a agregação de células-tronco embrionárias, proporcionando assim um bom ambiente para a formação de corpos de Embry. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que o número de células-tronco embrionárias agregadas em uma gota suspensa pode ser controlado variando o número de células na suspensão celular inicial. É isso.

Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.