Количественная активность СНГ-Регуляторных элементов в мышь Retina от эксплантов Электропорация

Общая цель данной процедуры заключается в электропорации имплантатов сетчатки мыши флуоресцентными транскрипционными репортерами и количественном определении уровней их экспрессии. Для этого сначала выделяют ткань сетчатки новорожденных мышей путем диссекции. Вторым этапом процедуры является электропорация сетчатки флуоресцентными ДНК-репортерными конструкциями.

Третьим этапом процедуры является культивирование электропорированных сеток в качестве имплантатов в течение восьми дней. Заключительным этапом процедуры является извлечение эксплантата сетчатки и количественное определение уровней экспрессии флуоресцентных репортеров. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие относительные уровни экспрессии различных конструкций промотор-репортер в развивающейся сетчатке мыши с помощью электропорации ex vivo эксплантата с последующим количественным анализом данных.

Меня зовут Джо Корбо, я сотрудник кафедры патологии и иммунологии медицинской школы Вашингтонского университета в Сент-Луисе. Сегодня мы представим видеопротокол, демонстрирующий методику электропорации эксплантатов сетчатки новорожденных мышей с целью количественного анализа активности специфических цис-регуляторных элементов фоторецепторов. Демонстрировать этот протокол будет аспирантка из моей лаборатории Синди Монтана. Сначала простерилизуйте камеру для электропорации и все инструменты 70% этанолом в preparation к сбору глаз.

Продезинфицируйте перчатки и поверхность рабочего стола этанолом и поддерживайте стерильные условия на протяжении всей процедуры. Затем, в ламинарном шкафу для культивирования тканей, перенесите с помощью пипетки 6 мл среды для диссекции в одну стерильную чашку Петри диаметром 60 мм и по 3 мл среды в две стерильные чашки диаметром 35 мм. Вернувшись к рабочему столу, продезинфицируйте голову и шею новорожденного мышонка 70% этанолом.

После быстрого обезглавливания с помощью ножниц перенесите голову в стерильный чашку диаметром 100 мм, удалите скальп маленькими ножницами, чтобы обнажить глаза под диссекционным микроскопом. С помощью изогнутого пинцета осторожно извлеките глаз из орбиты, а затем поместите его в чашку диаметром 35 мм, содержащую среду для диссекции. Продолжайте сбор глаз таким образом, чтобы на каждую аликвоту ДНК для электропорации приходилось от трех до четырех глаз, выдерживая глаза и среду для диссекции при комнатной температуре до завершения процедуры.

Продезинфицируйте лезвие бритвы и упаковку стерильной пластиковой переносной пипетки 70% этанолом, затем с помощью лезвия бритвы срежьте кончик пипетки так, чтобы отверстие было достаточно широким для переноса целого глаза. Используя расширенную пипетку, перенесите один глаз из чашки диаметром 35 мм в чашку диаметром 60 мм под стереомикроскопом при большом увеличении. С помощью тонкого пинцета удалите с поверхности глаза любые ткани, такие как внеглазные мышцы и жир.

Затем удалите зрительный нерв, пережав его у основания. Чтобы изолировать сетчатку, проколите небольшое отверстие в склере в области лимба; склера и ретинальный пигментный эпителий выглядят блестящими по сравнению с тканью сетчатки, которая имеет матовый серый цвет. Вставьте по одному зубцу из каждой пары пинцетов в отверстие и осторожно разорвите склеру и РПЭ.

Обязательно оставьте хрусталик на месте. С помощью расширенной пипетки перенесите препарированную сетчатку во вторую чашку диаметром 35 мм, содержащую среду. Соберите все сетчатки и поместите их в инкубатор для культур тканей при температуре 37 °C.

Перед началом электропорации, работая в ламинарном шкафу для культивирования тканей, для каждой аликвоты ДНК, предназначенной для электропорации, наполните одну стерильную чашку диаметром 35 мм диссекционным раствором, а вторую — культуральной средой. С помощью дозатора P 200 трижды промойте камеры в чашке для электропорации стерильным 1X PBS. Заполните камеры аликвотами ДНК объемом 60 µL, а все неиспользуемые камеры заполните 60 µL 1X PBS.

Подключите электроды к чашке для электропорации и введите соответствующие параметры в электропоратор. С помощью тонкого пинцета захватите сетчатки за хрусталики и перенесите их в камеры для электропорации, помещая до четырех сетчаток в каждую камеру.

Расположите сетчатки таким образом, чтобы линза прилегала к металлическому стержню, прикрепленному к положительному электроду. Протирайте пинцет после работы с каждой камерой, чтобы избежать переноса ДНК из одной камеры в другую. После выравнивания всех сетчаток нажмите кнопку запуска на электрофорезе.

На металлическом стержне, прикрепленном к отрицательному электроду, должны появиться крошечные пузырьки. С помощью пинцета отсоедините электроды и выключите источник питания. Осторожно отодвиньте сетчатки от стенок камеры.

Перенесите сетчатки из камер в чашки диаметром 35 миллиметров, содержащие среду для диссекции. С помощью стерильной трансфертной пипетки перенесите сетчатки из среды для диссекции в чашки диаметром 35 миллиметров с культуральной средой. Промаркируйте лунки стерильного шестилуночного культурального планшета и заполните каждую лунку тремя миллилитрами культуральной среды.

С помощью стерильного пинцета аккуратно поместите круглые фильтры Whatman Nucleo на поверхность среды в каждой лунке так, чтобы глянцевая сторона фильтра была обращена вверх. С помощью dissecting scope перенесите одну сетчатку на фильтр с помощью стерильной переносной пипетки, расположив её стороной хрусталика вниз. Если сетчатка легла стороной хрусталика вверх, втяните её обратно в пипетку и повторите попытку.

Поместите не более четырех сетчаток в каждую лунку, располагая их в отдельных каплях. После помещения сетчаток в лунки перенесите культуральную пластину в инкубатор для тканей при температуре 37 °C и культивируйте в течение требуемого времени. Обычно восемь дней; при успешной электропорации это приводит к экспрессии ДНК-конструкта на одной четверти или одной трети поверхности сетчатки.

Уровни флуоресценции количественно определяют путем сравнения равномерно электропорированных областей, экспрессирующих конструкцию CRE, с областями за пределами сетчатки с последующей нормализацией по контрольной экспрессии GFP. В частности, показана эффективная трансдукция палочковидных фоторецепторов. Здесь представлены результаты электропорации, при которой два специфических для палочек промотора обеспечивают экспрессию GFP и DS red в наружном ядерном слое.

При наложении двух паттернов экспрессии на окрашивание DPI, показанное здесь синим цветом, становится очевидной специфическая экспрессия в фоторецепторах. Экспрессия не наблюдается ни в внутреннем с Rac-слое, ни в слое ганглионарных клеток. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как проводить выделение и культивирование эксплантатов сетчатки мыши с целью количественной оценки активности регуляторных элементов цист сетчатки.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.