Количественная активность СНГ-Регуляторных элементов в мышь Retina от эксплантов Электропорация

Общая цель этой процедуры заключается в электроочистке мышиных имплантатов сетчатки с помощью флуоресцентных транскрипционных репортеров и количественной оценке уровня их экспрессии. Это достигается путем выделения ткани сетчатки новорожденной мыши путем диссекции. Вторым этапом процедуры является электроснабжение сетчатки с помощью флуоресцентных репортерных конструкций ДНК.

Третьим этапом процедуры является культивирование электропорированной сетчатки в качестве имплантатов в течение восьми дней. Заключительным этапом процедуры является сбор данных о сетчатке и количественная оценка уровней экспрессии флуоресцентных репортеров. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают относительные уровни экспрессии различных промоторных репортерных конструкций в развивающейся сетчатке мыши с помощью электропорации x explan с последующим количественным анализом данных.

Меня зовут Джо Корбо, и я преподаю на кафедре патологии и иммунологии в Медицинской школе Вашингтонского университета в Сент-Луисе. И сегодня мы представим видеопротокол, демонстрирующий технику электропорации X-explan в сетчатку новорожденных мышей с целью количественной оценки активности фоторецепторно-специфических регуляторных элементов CYS, и продемонстрирует этот протокол аспирант из моей лаборатории, Синди Монтана. Сначала простерилизуйте камеру электропорации и все инструменты с 70% этанолом при подготовке к забору глаз.

Продезинфицируйте перчатки и столешницу этанолом и поддерживайте стерильные условия на протяжении всей процедуры. Далее в тканевый культуральный капюшон пипетку помещают шесть миллилитров диссекционной среды в одну стерильную 60-миллиметровую чашку Петри, и три миллилитра среды в две стерильные 35-миллиметровые чашки. Вернувшись на стол, продезинфицируйте голову и шею новорожденного детеныша мыши с помощью 70% этанола.

Быстро обезглавив голову с помощью ножниц, перенесите голову в стерильную 100-миллиметровую посуду, срежьте волосистую часть головы маленькими ножницами, чтобы обнажить глаза под препарирующим микроскопом. С помощью изогнутых щипцов аккуратно выведите глаз из орбиты, а затем поместите глаз в 35-миллиметровую чашку, содержащую диссекцию. Терпимая. Продолжайте собирать глаза таким образом, чтобы на каждую аликвоту ДНК, подлежащей электропорации, приходилось три-четыре глаза, сохраняя глаза и среду для вскрытия при комнатной температуре до тех пор, пока они не закончатся.

Продезинфицируйте лезвие бритвы и обертку стерильной пластиковой пипетки с 70% этанолом, а затем с помощью лезвия бритвы отрежьте кончик пипетки достаточно высоко, чтобы можно было провести пипетку на целый глаз. С помощью расширенной пипетки перенесите один глаз из 35-миллиметровой чашки в 60-миллиметровую чашку под препарирующий микроскоп на высокой мощности. Используйте тонкие щипцы для удаления любых тканей, таких как экстраокулярные мышцы и жир с поверхности глаза.

Затем удалите зрительный нерв, пережав его у основания. Для того, чтобы изолировать сетчатку, проделайте небольшое отверстие в склере в лимбе, склера и пигментный эпителий сетчатки кажутся блестящими по отношению к ткани сетчатки, которая имеет матовый серый цвет. Вставьте в отверстие по одному зубцу от обеих пар щипцов и аккуратно разорвите склеры и РПЭ.

Обязательно оставьте объектив на месте. С помощью расширенной пипетки переместите рассеченную сетчатку во вторую 35-миллиметровую чашку, содержащую медиум. Соберите все сетчатки и храните их в инкубаторе для культуры тканей при температуре 37 градусов Цельсия.

До тех пор, пока электропорация не будет работать в тканевом культурном колпаке для каждой ДНК Eloqua, которую нужно электропорировать, заполните одну стерильную 35-миллиметровую чашку средой для препарирования, а вторую чашку — питательной средой. С помощью пипетки P 200 промыть камеры в электропорационной чашке стерильным XPB S3 раза. Заполните камеры 60 микролитрами аликвот ДНК и заполните все неиспользуемые камеры 60 микролитрами одного XPBS.

Подключите электроды к чашке для электропорации и введите соответствующие настройки на электро. С помощью тонких щипцов захватите сетчатку за хрусталик и перенесите их в камеры электропорации. Размещение до четырех сетчаток в каждой камере.

Расположите сетчатку так, чтобы хрусталик упирался в металлический стержень, прикрепленный к положительному электроду. Протрите щипцы между каждой камерой, чтобы избежать переноса ДНК из одной камеры в другую. Как только все сетчатки будут выровнены, нажмите «Старт» на электро.

На металлическом стержне, прикрепленном к отрицательному электроду, должны образоваться крошечные пузырьки. Отсоедините электроды и выключите электро с помощью щипцов. Аккуратно отодвиньте сетчатку от стенок камеры.

Перенесите сетчатку из камер в 35-миллиметровые чашки, содержащие среду для препарирования. С помощью стерильной передаточной пипетки перенесите сетчатку из диссекционной среды в 35-миллиметровые чашки, содержащие питательную среду. Наклейте этикетки на стерильную шестилуночную культуральную пластину и заполните каждую лунку тремя миллилитрами культуры. Терпимая.

С помощью стерильных щипцов установите круглые нуклеофильтры Ватмана на среду в каждой лунке блестящей стороной фильтров вверх. С помощью препарирующего эндоскопа перенесите одну сетчатку на фильтр стерильной переносной линзой пипетки вниз. Если сетчатка приземляется линзой вверх, втяните ее обратно в пипетку и повторите попытку.

Поместите в каждую лунку не более четырех сетчаток и храните их отдельными каплями. После того, как сетчатка будет помещена в лунки, переместите культуральную пластину в инкубатор для культуры тканей с температурой 37 градусов Цельсия и выращивайте в течение желаемого количества времени. Обычно в течение восьми дней наблюдается успешная электропорация, что приводит к экспрессии конструкции ДНК на одной четверти или одной трети поверхности сетчатки.

Уровни флуоресценции количественно оцениваются путем сравнения равномерно электропорированных областей, экспрессирующих конструкцию CRE, с областями за пределами сетчатки, а затем нормализуются для контроля экспрессии GFP. Показано, в частности, эффективно преобразуются палочковые фоторецепторы. Вот результаты электропорации, в которой два специфичных для стержня промотора стимулируют экспрессию GFP и DS красного цвета во внешнем ядерном слое.

Наложение двух паттернов выражения лица с окрашиванием DPI, показанным здесь синим цветом, становится очевидным выражение, специфичное для фоторецептора. Никакой экспрессии не наблюдается ни в слое интерклира, ни в слое ганглиозных клеток. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как препарировать электро и культуру мышиных эксплантов сетчатки с целью количественной оценки активности регуляторных элементов кисты сетчатки.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.