Скрининговый анализ низкомолекулярных нематицидов: метод скрининга потенциальных нематицидов против Ditylenchus dipsaci со средней пропускной способностью

Паразитирующие на растениях нематоды, такие как Ditylenchus dipsaci, являются микроскопическими червями. Живые черви демонстрируют синусоидальные движения за счет мышечных сокращений, и их подвижность является важным фактором, определяющим их здоровье в условиях культивирования.

Воздействие нематицидов - химических токсикантов, может вмешиваться в ключевые биологические процессы, влияя на подвижность этих культивируемых нематод, приводя к их гибели.

Для скрининга низкомолекулярных нематицидов берут дистиллированную водусодержащую многолуночную пластину. Используя инструмент для чистых штифтов, перенесите потенциальные низкомолекулярные нематоциды с химического запаса на планшет для анализа, чтобы обеспечить перенос постоянного количества молекул в каждую лунку.

Выдайте равное количество нематод в каждую лунку тарелки. Запечатайте пластины, поддерживая влажные условия, чтобы поддерживать выживание и подвижность нематод. Инкубируйте тарелку при слабом перемешивании, чтобы предотвратить поселение червей.

Во время инкубации различные токсичные малые молекулы воздействуют на червей и убивают их, в то время как нетоксичные не оказывают никакого воздействия. Рассмотрите планшет под препарирующим микроскопом, чтобы определить скважины с популяцией неподвижных червей.

Дополните пробирные пластины раствором гидроксида натрия - конечным химическим стимулятором. Это запускает движение любых отдыхающих червей и отличает их от мертвых.

Наличие в некоторых скважинах неподвижных червей после обработки гидроксидом натрия подтверждает эффективность соответствующих малых молекул в качестве нематицидов.

Для приготовления пробирных планшетов налейте автоклавную дистиллированную воду в стерильное корыто и выдайте по 40 микролитров дистиллированной воды из корыта в каждую лунку плоскодонного 96-луночного планшета с многоканальной пипеткой. Добавьте химикаты из 96-луночных химических планшетов в пробирные пластины, трижды приколов их к химической пластине. Затем перенесите булавки 10 раз в пробирную пластину. Промокните на бумаге перед чистящим раствором.

Чтобы подсчитать количество нематод из сбора, сначала повторно суспендируйте сбор, а затем нанесите пипеткой 5 микролитров раствора с помощью наконечников с низким удержанием на предметное стекло. Посчитайте количество нематод в 5 микролитрах с помощью вскрытия микроскопа. Затем отрегулируйте концентрацию до двух червей на микролитр, используя стерильную дистиллированную воду.

Далее добавьте по 10 микролитров образца в каждую лунку из 96-луночных планшетов с многоканальной пипеткой и корытом. Оберните тарелки влажным бумажным полотенцем и поместите их в коробку. Затем добавьте дополнительное влажное бумажное полотенце, чтобы стабилизировать и обеспечить минимальное перемещение пластин, и прикрепите на липкую подушечку в 20-градусном инкубаторе для встряхивания при температуре 20 градусов Цельсия, установленном на 200 оборотов в минуту.

Наблюдайте за планшетами на 5-й день под препарирующим микроскопом. Подсчитайте количество подвижных и общих D. dipsaci в контрольных группах растворителей ДМСО и лунках, обработанных лекарственными препаратами.

Если черви неподвижны, добавьте в лунку 2 микролитра 1 моляра гидроксида натрия до конечной концентрации 40 миллимоляров для стимуляции движения. Рассчитайте долю мобильных червей. На грохотах D. dipsaci скважины, которые воспроизводимо дали 0% подвижных червей, классифицируются как сильные попадания.