Определение связывания витронектина с бактериальными поверхностями с помощью проточной цитометрии
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 3:05 мин • July 8th, 2025
Возьмем проточные цитометрические трубки, содержащие дикий тип и мутантные штаммы Haemophilus influenzae, тип f.
Пипеткой введите буфер, содержащий блокирующие белки и витронектин. Инкубировать.
Блокирующие белки уменьшают неспецифические взаимодействия на бактериальной поверхности, в то время как молекулы витронектина связываются с белком H, связывающим витронектин-связывающий белок, на бактериальных поверхностях дикого типа. В мутантном штамме витронектин не связывается из-за отсутствия белка Н.
центрифуга. Удалите несвязанный витронектин и блокирующие белки.
Добавьте буфер, содержащий первичные антитела к витронектину, которые специфически связываются с витронектином, прикрепленным к поверхности бактерий дикого типа.
Затем вводят флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами на витронектине и облегчают обнаружение витронектина.
центрифуга. Удалите несвязанные вторичные антитела. Ресуспендируйте бактерии в буфере.
Проведите проточную цитометрию для определения связывания витронектина с поверхностью бактерии.
Сравните сигналы флуоресценции дикого типа и мутантных штаммов. Сдвиг сигнала флуоресценции у бактерий дикого типа подтверждает связывание витронектина с бактериальной поверхностью.
Для подготовки к проточной цитометрии необходимо повторно суспендировать бактериальные гранулы 50 микролитрами блокирующего буфера, содержащего 250 наномолярных витронектинов. Затем инкубируйте образцы в течение 1 часа при комнатной температуре без встряхивания. После инкубации гранулируйте бактерии центрифугированием при давлении 3500 x g в течение 5 минут. Затем промойте гранулы три раза с помощью PBS и аналогичных ступеней центрифугирования.
После промывки добавьте 50 микролитров первичных поликлональных антител овцы против витронектина человека в бактериальную гранулу в разведении от 1 до 100 в PBS/BSA. Выдержать суспензию в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем трижды промойте бактерии PBS, чтобы удалить несвязанные антитела.
Затем добавьте в гранулу 50 микролитров PBS/BSA, содержащих флуоресцеин изотиоцианат-конъюгированный ослиный поликлональные антитела против овец. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте. Наконец, после трех этапов промывки, повторно суспендируйте бактериальную гранулу 300 микролитрами PBS и проанализируйте с помощью проточной цитометрии.
Обзор
В данном исследовании с помощью проточной цитометрии изучается связывание витронектина с диким типом и мутантными штаммами Haemophilus influenzae типа f. Наличие белка H в штаммах дикого типа обеспечивает связывание витронектина, тогда как в мутантных штаммах это взаимодействие отсутствует.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Иммунология
- Проточная цитометрия
Теоретические сведения
- Haemophilus influenzae является значимым бактериальным патогеном.
- Витронектин — это гликопротеин, участвующий в различных биологических процессах.
- Белок H играет ключевую роль в связывании витронектина в штаммах дикого типа.
- Понимание этих взаимодействий может помочь в разработке терапевтических стратегий.
Цель исследования
- Оценка связывания витронектина с поверхностями бактерий.
- Сравнение связывания между штаммами дикого типа и мутантными штаммами.
- Использование проточной цитометрии для количественной оценки взаимодействий связывания.
Используемые методы
- Подготовка бактериальных штаммов и инкубация с блокирующими белками.
- Использование первичных и вторичных антител для детекции витронектина.
- Этапы центрифугирования и промывки для выделения связанных белков.
- Анализ методом проточной цитометрии для измерения сигналов флуоресценции.
Основные результаты
- Штаммы дикого типа продемонстрировали значительное связывание с витронектином.
- Мутантные штаммы не проявляли связывания из-за отсутствия белка H.
- Сдвиги сигнала флуоресценции подтвердили наличие взаимодействий связывания.
- Проточная цитометрия позволила эффективно количественно оценить эти различия.
Выводы
- Связывание витронектина зависит от наличия белка H.
- Проточная цитометрия является ценным инструментом для изучения бактериальных взаимодействий.
- Эти результаты могут иметь значение для понимания патогенеза бактерий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественное определение связывания витронектина с поверхностью бактерий с помощью проточной цитометрии позволяет точно исследовать взаимодействия между хозяином и патогеном на молекулярном уровне. Данный подход способствует валидации мишеней на ранних этапах и снижению механистических рисков при разработке портфелей противоинфекционных препаратов. Надежное измерение белково-лигандных взаимодействий повышает прогностическую достоверность при отборе кандидатов и в трансляционных исследованиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую оценить функцию поверхностных белков бактерий в опосредовании связывания с факторами хозяина.
- Обеспечивает механистическую проверку гипотез (de-risking) путем разграничения фенотипов дикого типа и мутантов на основе количественных данных о связывании.
- Способствует функциональной валидации мишеней для разработки стратегий против адгезии или устойчивости к сыворотке.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создать воспроизводимый количественный анализ для оценки взаимодействий бактериальной поверхности с белками хозяина.
- Обеспечивает стандартизированные показатели флуоресценции, подходящие для сравнительного анализа различных штаммов или условий.
- Позволяет проводить последующий скрининг ингибиторов или модуляторов связывания белка с лигандом.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет данные о связывании in vitro с механизмами бактериальной адгезии и ускользания от иммунного ответа, имеющими значение для развития заболевания.
- Обеспечивает преемственность от молекулярного поиска до валидации противоинфекционных мишеней на доклинических моделях.
- Позволяет обоснованно оценивать риски при продвижении кандидатов, воздействующих на интерфейс «хозяин-патоген».
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод детекции на основе проточной цитометрии интегрируется в непрерывный цикл исследований и разработок противоинфекционных препаратов — от этапа поиска кандидатов до доклинических испытаний.
- Биологические исследования: позволяет количественно определить связывание специфических белков хозяина с бактериальными мишенями, что помогает уточнить механистические гипотезы.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных и воспроизводимых данных флуоресценции для сравнения различных штаммов или соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных для проведения надежного статистического анализа.
- Трансляционные исследования: позволяют связать молекулярные данные с бактериальными фенотипами, имеющими значение для развития заболевания.
- Корпоративное повторное использование: предлагает платформенный метод анализа, который может быть адаптирован для различных бактериальных штаммов и факторов хозяина.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней и понимании механизмов действия.
- Операционная ценность: стандартизирует методы обнаружения белок-лигандных взаимодействий для создания воспроизводимых и масштабируемых рабочих процессов.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях в портфелях противоинфекционных препаратов.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию кандидатов с учетом рисков, нацеленных на адгезию бактерий или устойчивость к сыворотке крови.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области проточной цитометрии и методов детектирования с использованием антител.
- Необходим доступ к валидированным антителам и оборудованию для флуоресцентной цитометрии.
- Требуется строгая стандартизация условий анализа и контролей между всеми исследовательскими группами.
- Метод применим к различным бактериальным штаммам с соответствующей экспрессией поверхностных белков.
- Результативность зависит от наличия высококачественных реагентов и единообразия подготовки образцов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Проточной цитометрии на основе анализа на мониторинге NK клеточных функций
Похожие видео
0 Просмотры
Количественная оценка норовируса человека, как частицы, связывающиеся с commensal бактерий использованием потока цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Поляризация клеток M1 и M2 человека моноцитов и анализ с цитометрией потока при микобактериальной туберкулезной инфекции
Похожие видео
0 Просмотры
Закрытые нуклеиновых кислот цитометрии потока флуоресценции На месте Гибридизация (LNA поток-FISH): Метод бактериального Малый обнаружения РНК
Похожие видео
0 Просмотры
Анализируя сотовой Интернализация наночастиц и бактерий нескольких спектральных изображений проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ для изучения роли витронектина в адгезии бактерий к эпителиальным клеткам хозяина
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ для количественной оценки связывания VLP норовируса человека с кишечными бактериями
Похожие видео
0 Просмотры
Обнаружение Люминесцентные наночастиц Взаимодействие с первичного иммунного субпопуляциях Сотовые помощью проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Измерение Вложений и интернализации вируса гриппа в клетках А549 методом проточной цитометрии
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 22 августа 2026