Определение связывания витронектина с бактериальными поверхностями с помощью проточной цитометрии

Возьмем проточные цитометрические трубки, содержащие дикий тип и мутантные штаммы Haemophilus influenzae, тип f.

Пипеткой введите буфер, содержащий блокирующие белки и витронектин. Инкубировать.

Блокирующие белки уменьшают неспецифические взаимодействия на бактериальной поверхности, в то время как молекулы витронектина связываются с белком H, связывающим витронектин-связывающий белок, на бактериальных поверхностях дикого типа. В мутантном штамме витронектин не связывается из-за отсутствия белка Н.

центрифуга. Удалите несвязанный витронектин и блокирующие белки.

Добавьте буфер, содержащий первичные антитела к витронектину, которые специфически связываются с витронектином, прикрепленным к поверхности бактерий дикого типа.

Затем вводят флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами на витронектине и облегчают обнаружение витронектина.

центрифуга. Удалите несвязанные вторичные антитела. Ресуспендируйте бактерии в буфере.

Проведите проточную цитометрию для определения связывания витронектина с поверхностью бактерии.

Сравните сигналы флуоресценции дикого типа и мутантных штаммов. Сдвиг сигнала флуоресценции у бактерий дикого типа подтверждает св