Определение связывания витронектина с бактериальными поверхностями с помощью проточной цитометрии

Возьмем проточные цитометрические трубки, содержащие дикий тип и мутантные штаммы Haemophilus influenzae, тип f.

Пипеткой введите буфер, содержащий блокирующие белки и витронектин. Инкубировать.

Блокирующие белки уменьшают неспецифические взаимодействия на бактериальной поверхности, в то время как молекулы витронектина связываются с белком H, связывающим витронектин-связывающий белок, на бактериальных поверхностях дикого типа. В мутантном штамме витронектин не связывается из-за отсутствия белка Н.

центрифуга. Удалите несвязанный витронектин и блокирующие белки.

Добавьте буфер, содержащий первичные антитела к витронектину, которые специфически связываются с витронектином, прикрепленным к поверхности бактерий дикого типа.

Затем вводят флуорофор-конъюгированные вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами на витронектине и облегчают обнаружение витронектина.

центрифуга. Удалите несвязанные вторичные антитела. Ресуспендируйте бактерии в буфере.

Проведите проточную цитометрию для определения связывания витронектина с поверхностью бактерии.

Сравните сигналы флуоресценции дикого типа и мутантных штаммов. Сдвиг сигнала флуоресценции у бактерий дикого типа подтверждает связывание витронектина с бактериальной поверхностью.

Для подготовки к проточной цитометрии необходимо повторно суспендировать бактериальные гранулы 50 микролитрами блокирующего буфера, содержащего 250 наномолярных витронектинов. Затем инкубируйте образцы в течение 1 часа при комнатной температуре без встряхивания. После инкубации гранулируйте бактерии центрифугированием при давлении 3500 x g в течение 5 минут. Затем промойте гранулы три раза с помощью PBS и аналогичных ступеней центрифугирования.

После промывки добавьте 50 микролитров первичных поликлональных антител овцы против витронектина человека в бактериальную гранулу в разведении от 1 до 100 в PBS/BSA. Выдержать суспензию в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем трижды промойте бактерии PBS, чтобы удалить несвязанные антитела.

Затем добавьте в гранулу 50 микролитров PBS/BSA, содержащих флуоресцеин изотиоцианат-конъюгированный ослиный поликлональные антитела против овец. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте. Наконец, после трех этапов промывки, повторно суспендируйте бактериальную гранулу 300 микролитрами PBS и проанализируйте с помощью проточной цитометрии.