CometChip: Высокая пропускная 96-Ну Платформа для измерения повреждений ДНК в Microarrayed клетках человека

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как использовать чип COMET для выполнения высокопроизводительных измерений повреждений ДНК в клетках млекопитающих. Это достигается путем предварительной загрузки клеток млекопитающих в чип COMET. Второй шаг заключается в обработке клеток химическими веществами, которые, как известно, вызывают повреждение ДНК.

Далее клетки лизируются и обрабатываются методом Electro East с использованием традиционных протоколов анализа COMET. Заключительным этапом является флуоресцентная визуализация клеточной ДНК для визуализации миграции поврежденной ДНК. В конечном счете, программное обеспечение для анализа изображений используется для количественной оценки степени повреждения ДНК.

Таким образом, COM-анализ существует уже очень давно, и это очень полезный анализ для изучения множества различных видов повреждений ДНК. Но проблема заключалась в том, что у него очень низкая пропускная способность и ему не хватало чувствительности. Поэтому мы создали чип COMET, который по сути является очень высокопроизводительной версией анализа COMET, позволяющей проводить высокопроизводительный скрининг, например, для скрининга лекарств и эпидемиологических исследований.

Аспирант Цзин Га в моей лаборатории будет демонстрировать эту процедуру. Коматозный чип представляет собой гель с массивом микролунок, изготовленных из микроштампа с микроштифтами диаметром такой же малый, как у одной клетки, чтобы начать помещать его в однолуночную прямоугольную пластину для связывания гелевой пленки стороной вниз. После стирки геля дважды по 25 миллилитров в одном XPBS установите чип запятой на стеклянную пластину, затем нанесите соответствующую маркировку на ориентацию геля.

Теперь аккуратно вдавите в гель перевернутую бездонную 96-луночную пластину, следя за тем, чтобы все 96 лунок находились в области геля. Затем прикрепите обе стороны 96-луночной пластины к стеклянной пластине с помощью 1,5-дюймовых связующих зажимов. Наконец, отсасывайте избыток PBS из каждого из них.

Хорошо соберите суспензию или адгезивные клетки в соответствии со стандартной методикой и разбавьте клетки средой до конечной концентрации от 100 000 до 1 миллиона клеток на миллилитр. Убедитесь, что суспензия одной клетки получена путем пропускания через фильтр ячеек, если это необходимо. Пипеткой внесите по 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку, комета чипа 96 лунок планшета по окончанию.

Накройте пластину гелевой пленкой, чтобы предотвратить испарение, а затем поместите в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов Цельсия, на 30 минут после извлечения пластины из инкубатора. По истечении 30 минут отсасывайте среду из каждого, затем снимите связующие зажимы и бездонную пластину 96 лунок Держите комета со стеклянной пластиной под углом и осторожно промойте одним XPBS, чтобы удалить лишние клетки поверх арос. Теперь посмотрите на пластину через объектив с четырехкратным увеличением на светлопольном микроскопе, чтобы проверить оптимальную нагрузку на ячейки После того, как достаточное количество элементов загружено, поместите com-чип на ровную поверхность, накладку с низкой температурой плавления 1%, которая была предварительно прогрета до 37 градусов Цельсия.

Дайте покрытию застыть при комнатной температуре в течение трех минут, а затем поместите его на четыре градуса Цельсия на пять минут для полного датирования, чтобы дозировать клетки с интересующими их химическими веществами. Сначала тщательно совместите лунки кометного чипа с лунками новой бездонной 96-луночной пластины и прижмите вниз. Закрепите пластину 96 лунки на стеклянной пластине с помощью связующих зажимов, как и раньше.

Затем поместите планшет на лед и добавьте 100 микролитров интересующего химического вещества в желаемой дозе В каждую лунку дайте исследуемому химическому веществу остаться на клетках с желаемым периодом времени после дозирования, отасуньте химический раствор из каждой лунки и промойте одним XPBS при необходимости. Разрежьте гель на отдельные кусочки. Затем для изучения кинетики репарации добавляют питательные среды в лунки, инкубируют и приступают к лизису клеток в определенные моменты времени к LY-клеткам для анализа щелочной кометы.

Приготовьте примерно 25 миллилитров рабочего буфера для щелочного лизиса для каждой микросхемы, добавив 1% Triton X 100 в исходный раствор щелочного лизиса. Затем предварительно охладите до четырех градусов по Цельсию. Сцедите буфер щелочного лизиса в контейнер размером чуть больше кометного чипа.

Затем погрузите щелочную стружку в охлажденный рабочий буфер для щелочного лизиса в холодильник и дайте продолжить лизис в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день удалите кометный чип из буфера для лизиса и быстро погаснет одним XPBS. Затем поместите чип в камеру электрофореза стороной гелевой пленки вниз и закрепите двусторонним скотчем.

Поднимите камеру на температуру четыре градуса Цельсия в холодную камеру и заполните камеру холодным щелочным буфером для электрофореза до уровня, который как раз покрывает гель. Затем оставьте чип при температуре четыре градуса Цельсия на 40 минут, чтобы дать возможность щелочной раскрутке. Наконец, запустите гель с напряжением один вольт на сантиметр и 300 миллиампер в течение 30 минут.

В холодильной камере отрегулируйте объем буфера электрофореза в камере для достижения желаемого рабочего тока. Для анализа нейтральных комет сделайте рабочий нейтральный буфер для лизиса, добавив 1% Triton X 110% DMSO в исходный раствор нейтрального лисиса. Опять же, готовим примерно 25 миллилитров рабочего буфера для лизиса для каждого чипа.

Поместите рабочий нейтральный буфер для лизиса в инкубатор, установленный на 43 градуса Цельсия, для предварительного нагрева. После того, как нейтральный буфер для лизиса нагреется, погрузите чип с запятой в буфер для нейтрального лизиса и поместите в инкубатор при температуре 40 градусов Цельсия на ночь. На следующий день удалите нейтральный буфер для лизиса, а затем дважды повторите с нейтральным буфером для электрофореза в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия Каждый раз закрепите чип в камере электрофореза и перенесите в холодную камеру.

Как и раньше, заполните камеру электрофореза холодным нейтральным буфером для электрофореза до уровня, который просто покрывает гель, и дайте гелю постоять в холодной комнате в течение 60 минут, запустите гель при напряжении 0,6 вольта на сантиметр и шести миллиамперах в течение 60 минут в холодной комнате. Снова отрегулируйте объем буфера электрофореза в камере, чтобы при необходимости достичь желаемого рабочего тока. После извлечения ком-чипа из холодильной камеры нейтрализуйте гели путем промывки и нейтрализации буфера дважды по 15 минут каждый при четырех градусах Цельсия.

Оставайтесь в чипе с флуоресцентным пятном ДНК, таким как киберг-золото или бромид иридия. В соответствии с инструкциями производителя и полученным с помощью флуоресцентной микроскопии репрезентативным изображением кометы Microwell из необработанных ТЗ шести лимфобластов показаны на верхней панели этой диаграммы. Те, кто из шести элементов ТЗ, подвергались воздействию 50 микромолял перекиси водорода в средней панели и 100 микромолярной перекиси водорода в нижней панели.

Все выдержки были в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. На этом линейном графике показана реакция на дозу перекиси водорода шести клеток ТЗ. Каждая точка данных является средним значением трех независимых экспериментов, в которых в каждом эксперименте был получен средний процент ДНК хвоста не менее 50 отдельных комет.

На этом графике показаны вариации анализа запятого чипа для ТЗ шести клеток, подвергшихся воздействию перекиси водорода, данные о проценте хвостовой ДНК каждой лунки. Каждый квадрат представляет медиану не менее 50 отдельных комет из каждой скважины. Среднее значение по 12 скважинам составляет 77 пунктов, стандартное отклонение составляет 3,99%, а коэффициент вариации составляет 5,2%. На этом графике показана вариация от эксперимента к эксперименту.

Одно и то же воздействие перекиси водорода повторялось шесть раз, и данные каждого повтора отображаются в виде серой полосы. Каждый прямоугольник представляет собой медианный процент хвостовой ДНК не менее 100 отдельных комет из каждого повтора. Среднее значение шести повторов составляет 49,57%, показанное здесь как задняя панель.

Стандартное отклонение шести повторов составляет 4,99%, а погрешность среднего значения составляет 2,04%, представленная в виде воздушной полосы на рисунке Как в традиционном общем анализе. Исследователи могут вносить изменения в эту процедуру или использовать другие методы, такие как включение очищенных ферментов, специфичных для поражения, чтобы ответить на дополнительные вопросы о типе повреждения ДНК, производимого в клетках. Метод кометного чипа проложил путь к изучению клеток млекопитающих, чтобы узнать о повреждении и восстановлении ДНК.

А благодаря высокой пропускной способности это позволяет проводить клинические и эпидемиологические исследования, которые раньше были просто невозможны из-за большого количества образцов.