Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить электрофизиологические записи всей клетки от нейронов оптического тектума головастика, чтобы узнать об их характере связи во время развития и, в конечном итоге, понять, как формируются и функционируют нейронные цепи. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития нейронов, такие как как изменение нейронов в ходе развития и как функционируют цепи, вызывающие поведение. Основное преимущество этих препаратов заключается в том, что они позволяют проводить электрофизиологическую регистрацию нейронов зрительного тектума, чтобы получить представление о функции развивающихся нейронных цепей.

Демонстрировать процедуру будет Чжэньюй Луй, аспирант моей лаборатории. С помощью пипетки для переноса обезболивания переместите обезболивающего головастика в записывающую чашку для вскрытия, содержащую раствор для наружной записи. Закрепите головастика под наркозом на погруженном силиконовом блоке на полу записывающей чашки для препарирования.

Чтобы получить четкое представление о мозге, удалите кожу, лежащую над мозгом, сделав поверхностный разрез по средней линии с помощью стерильной иглы 25 калибра. Профилируйте мозг вдоль той же оси средней линии, вставив иглу в нервную трубку и осторожно потянув вверх так, чтобы дорсальная часть трубки была аккуратно разрезана, при этом нижняя пластина осталась нетронутой. Чтобы изолировать мозг, сначала используйте иглу 25 калибра, чтобы отрезать задний мозг.

Затем осторожно проведите иглой под мозг в каудальном и ростральном направлении, чтобы разорвать все боковые и вентральные соединительные ткани и нервные волокна. Затем закрепите мозг на блоке силиконового эластомера, поместив один штифт через одну из обонятельных луковиц, а другой — через задний мозг. Это оптимальная конфигурация для записи с тектальных нейронов.

Затем переместите чашку, содержащую закрепленный препарат для всего мозга, из препарирующего эндоскопа в электрофизиологическую установку. Удалите желудочковую оболочку с помощью разбитой стеклянной пипетки. Чтобы непосредственно активировать аксоны RGC, осторожно опустите биполярный стимулирующий электрод на зрительный хиазму таким образом, чтобы в тканях образовалась небольшая вмятина.

Биполярный стимулирующий электрод должен быть ростральным и практически прилегать к большому среднему желудочку, где находится зрительный хиазма. Биполярный электрод приводится в движение импульсным стимулятором, что позволяет точно контролировать силу стимуляции. Чтобы приготовить горизонтальный срез мозга, начните с подготовки всего мозга.

Затем с помощью бритвенного лезвия иссеките самую латеральную четверть одной стороны одного из оптических тектумов. Этот разрез делается параллельно ростральной каудальной плоскости. После этого снова прикрепите мозг к стороне силиконового эластомера срезанной стороной вверх, чтобы можно было получить прямой доступ к сомате и нейропилю для записи, а желудочковая поверхность мозга была обращена в сторону от блока силиконового эластомера, чтобы можно было разместить биполярный электрод на зрительном хиазме.

Затем выполните запись всего клеточного патч-клэмпа или локального полевого потенциала. Вот схема, показывающая конфигурацию подготовки горизонтального среза мозга. Обратите внимание, что, хотя стимулирующий электрод остается на зрительном хиазме, записывающая пипетка теперь расположена таким образом, чтобы получить доступ к клеткам через все тектальные слои, подверженные подготовке горизонтального среза мозга.

Это вызванная РГК реакция нейрона, находящегося в поверхностном слое тектума. На этом рисунке зарегистрированные потенциалы поля на нейропиле и плотности преобразованного источника тока показаны с помощью графика изображения. После освоения этой техники можно выполнить в течение 10 минут и, как правило, до трех или четырех часов.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять подготовку всего мозга и горизонтального среза мозга для записи целых клеток, чтобы количественно оценить электрические свойства тектальных нейронов и их связность.