Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов
15 марта 2018 г.
В этой статье мы обсуждаем три мозга препаратов, используемых для записи зажим клеточных патч для изучения retinotectal цепь Xenopus laevis головастиков. Каждый подготовки, с свои собственные конкретные преимущества, способствует экспериментальной уступчивость Xenopus головастика как модель для изучения функции нейронные цепи.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить электрофизиологические записи всей клетки от нейронов оптического тектума головастика, чтобы узнать об их характере связи во время развития и, в конечном итоге, понять, как формируются и функционируют нейронные цепи. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития нейронов, такие как как изменение нейронов в ходе развития и как функционируют цепи, вызывающие поведение. Основное преимущество этих препаратов заключается в том, что они позволяют проводить электрофизиологическую регистрацию нейронов зрительного тектума, чтобы получить представление о функции развивающихся нейронных цепей.
Демонстрировать процедуру будет Чжэньюй Луй, аспирант моей лаборатории. С помощью пипетки для переноса обезболивания переместите обезболивающего головастика в записывающую чашку для вскрытия, содержащую раствор для наружной записи. Закрепите головастика под наркозом на погруженном силиконовом блоке на полу записывающей чашки для препарирования.
Чтобы получить четкое представление о мозге, удалите кожу, лежащую над мозгом, сделав поверхностный разрез по средней линии с помощью стерильной иглы 25 калибра. Профилируйте мозг вдоль той же оси средней линии, вставив иглу в нервную трубку и осторожно потянув вверх так, чтобы дорсальная часть трубки была аккуратно разрезана, при этом нижняя пластина осталась нетронутой. Чтобы изолировать мозг, сначала используйте иглу 25 калибра, чтобы отрезать задний мозг.
Затем осторожно проведите иглой под мозг в каудальном и ростральном направлении, чтобы разорвать все боковые и вентральные соединительные ткани и нервные волокна. Затем закрепите мозг на блоке силиконового эластомера, поместив один штифт через одну из обонятельных луковиц, а другой — через задний мозг. Это оптимальная конфигурация для записи с тектальных нейронов.
Затем переместите чашку, содержащую закрепленный препарат для всего мозга, из препарирующего эндоскопа в электрофизиологическую установку. Удалите желудочковую оболочку с помощью разбитой стеклянной пипетки. Чтобы непосредственно активировать аксоны RGC, осторожно опустите биполярный стимулирующий электрод на зрительный хиазму таким образом, чтобы в тканях образовалась небольшая вмятина.
Биполярный стимулирующий электрод должен быть ростральным и практически прилегать к большому среднему желудочку, где находится зрительный хиазма. Биполярный электрод приводится в движение импульсным стимулятором, что позволяет точно контролировать силу стимуляции. Чтобы приготовить горизонтальный срез мозга, начните с подготовки всего мозга.
Затем с помощью бритвенного лезвия иссеките самую латеральную четверть одной стороны одного из оптических тектумов. Этот разрез делается параллельно ростральной каудальной плоскости. После этого снова прикрепите мозг к стороне силиконового эластомера срезанной стороной вверх, чтобы можно было получить прямой доступ к сомате и нейропилю для записи, а желудочковая поверхность мозга была обращена в сторону от блока силиконового эластомера, чтобы можно было разместить биполярный электрод на зрительном хиазме.
Затем выполните запись всего клеточного патч-клэмпа или локального полевого потенциала. Вот схема, показывающая конфигурацию подготовки горизонтального среза мозга. Обратите внимание, что, хотя стимулирующий электрод остается на зрительном хиазме, записывающая пипетка теперь расположена таким образом, чтобы получить доступ к клеткам через все тектальные слои, подверженные подготовке горизонтального среза мозга.
Это вызванная РГК реакция нейрона, находящегося в поверхностном слое тектума. На этом рисунке зарегистрированные потенциалы поля на нейропиле и плотности преобразованного источника тока показаны с помощью графика изображения. После освоения этой техники можно выполнить в течение 10 минут и, как правило, до трех или четырех часов.
После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять подготовку всего мозга и горизонтального среза мозга для записи целых клеток, чтобы количественно оценить электрические свойства тектальных нейронов и их связность.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучаются методы локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в конфигурации «целая клетка» для анализа ретинотоектального тракта у головастиков Xenopus laevis. Используя различные варианты подготовки препарата головного мозга, авторы стремятся изучить паттерны связности нейронов в оптическом тектуме головастика в процессе развития, а также общую функцию нейронных цепей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Электрофизиология
- Нейронные цепи
Теоретические основы
- Исследование процессов формирования и функционирования нейронных цепей в развивающихся организмах.
- Ретинотоктальная цепь имеет решающее значение для зрительного восприятия у амфибий.
- Головастики Xenopus laevis служат ценной моделью для изучения нейронных связей.
- Регистрация активности всего клетки позволяет детально изучить активность нейронов.
Цель исследования
- Изучить закономерности связей между нейронами в зрительном холмике.
- Проанализировать, как нейроны изменяются в процессе развития.
- Исследовать вклад нейронных цепей в поведение.
Используемые методы
- Для проведения электрофизиологических записей использовались методы локальной фиксации потенциала на всей клетке (whole-cell patch clamp).
- В качестве биологической модели использовались препарированные головные мозги головастиков для изучения нейронов зрительного бугорка.
- Мультиомиксные рабочие процессы не упоминались.
- Конкретные этапы включали иммобилизацию головастика, выделение головного мозга и проведение целевых записей.
- Данные методы позволяют проводить запись в течение критического интервала в 10 минут, при этом общая продолжительность эксперимента обычно составляет несколько часов.
Основные результаты
- Подготовленные образцы позволили успешно зарегистрировать активность нейронов в тектуме.
- Наблюдались электрофизиологические изменения, свидетельствующие о наличии нейронных связей.
- Полученные результаты инициировали дискуссии о функциональном значении ретинототектального тракта.
- Результаты исследования способствуют пониманию развития нейронных цепей.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует эффективные методы изучения нейронных связей в развивающемся мозге головастиков.
- Работа расширяет понимание функционирования нейронных цепей в процессе развития.
- Полученные результаты имеют более широкое значение для изучения неврологических процессов и поведения земноводных.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость для руководителей
Регистрация потенциалов методом локального притока (patch-clamp) из всей клетки головастиков Xenopus laevis позволяет с высоким разрешением исследовать формирование и функционирование нейронных цепей, обеспечивая понимание механизмов синаптической связности и возбудимости нейронов в процессе развития. Данный подход способствует валидации мишеней в нейронауках, позволяя напрямую измерять ответы нейронов на определенные стимулы, такие как активность в There optic tectum, вызванная ганглионарными клетками сетчатки. Адаптивность метода для использования in vivo, на целом мозге и на горизонтальных срезах повышает воспроизводимость и масштабируемость при доклинической оценке рисков мишеней нейроразвития.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки нейронных ответов на сенсорные стимулы, что проясняет функциональную связность в развивающихся нейронных цепях.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямого электрофизиологического считывания нейронной активности, что уменьшает неопределенность при оценке взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: облегчает отбор проектов в портфеле путем установления связи между генетическими или фармакологическими воздействиями и измеримыми изменениями возбудимости нейронов тектума и синаптической интеграции.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений путем создания стабильных, пригодных для регистрации нейронных препаратов с определенными свойствами стимул-реакции.
- Количественные показатели: Получение электрофизиологических измерений, таких как постсинаптические токи и полевые потенциалы, что позволяет проводить анализ зависимости «доза-эффект» и количественную оценку воздействия соединений.
- Повторное использование платформы: Приготовление горизонтальных срезов мозга позволяет проводить запись во всех слоях крыши среднего мозга, что повышает пропускную способность и согласованность данных при повторных экспериментальных сессиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует процессы нейроразвития, имеющие значение для расстройств, связанных с неправильным формированием нейронных связей, что способствует поиску трансляционных биомаркеров.
- Преклиническая преемственность: Обеспечивает связь между этапами поиска и валидации за счет возможности стабильной регистрации функций нейронов на разных стадиях развития.
- Решения с учетом рисков: Позволяет определять критерии принятия решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе электрофизиологических фенотипов, снижая риск неудач на поздних этапах программ по изучению нейроразвития.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска путем обеспечения функциональной валидации нейрональных мишеней перед оптимизацией соединений-лидеров, при этом полученные результаты позволяют уточнить выбор мишени и углубить понимание механизмов действия.
- Открывательная биология: Поддерживает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов путем записи вызванных ответов нейронов крыши среднего мозга после стимуляции аксонов ганглионарных клеток сетчатки.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизацию анализа за счет воспроизводимых препаратов всего мозга и срезов мозга, что позволяет получать количественные электрофизиологические показатели для скрининга соединений.
- Аналитика: Обеспечивает количественное измерение зависимых переменных, таких как амплитуда тока и латентный период, что облегчает сравнение различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает доклиническую валидность за счет сохранения свойств цепей, имеющих значение при заболеваниях, в различных препаратах, что способствует согласованию биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую электрофизиологическую платформу, адаптируемую к различным экспериментальным контекстам, что сокращает необходимость в избыточной разработке методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности благодаря прямой регистрации нейронной активности.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и стандартизацию между лабораториями благодаря четко определенным протоколам подготовки для методов in vivo, исследования всего мозга и срезов.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах выявлять неэффективные соединения, что сокращает инвестиции в нежизнеспособные мишени.
- Влияние на портфель: обосновывает решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков, связывая электрофизиологические результаты с функциями на уровне нейронных цепей.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области электрофизиологии и методов микрохирургического препарирования для обеспечения стабильного качества подготовки препарата мозга.
- Результаты зависят от стабильности растворов для внеклеточной регистрации и исправности оборудования для стимуляции, что необходимо для получения надежных вызванных ответов.
- Необходима стандартизация параметров стимула и настроек регистрации между исследовательскими группами для обеспечения сопоставимости данных.
- Адаптация метода для различных модельных систем может потребовать корректировки способов препарирования и выкладки срезов в зависимости от размера и доступности отделов мозга.
- Практические ограничения включают зависимость успешности процедуры от оператора и стабильность препарата в ходе длительных сеансов регистрации.
