Формирование Анализ Soft Агар колонии

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке независимого роста клеточной опоры. Это достигается путем нанесения слоя агара на пластину для клеточной культуры и предоставления ему возможности затвердеть. Второй шаг заключается в нанесении смеси ячеек в агаре поверх предыдущего слоя агара.

Затем клеткам дают образовать колонии в течение нескольких недель. Последним шагом является окрашивание колоний для визуализации и количественной оценки. В конечном счете, анализ образования колоний мягких агаров используется для того, чтобы показать независимый рост по Анкориджу в качестве признака клеточной трансформации.

Основное преимущество этого метода по сравнению с другими методами, такими как клон-генный анализ, заключается в том, что анализ образования колоний мягкого агара требует, чтобы клетки образовывали колонии независимым по Анкориджу способом. Начните процедуру с маркировки каждой лунки обработанной культуры тканей. Шестилуночный планшет подходит для каждой исследуемой клеточной линии или состояния.

Затем приготовьте две питательные среды Xcel, растворив один грамм порошковой среды и 0,2 грамма бикарбоната натрия в деионизированной воде до конечного объема 50 миллилитров. Пропустите эту среду через фильтр 0,2 микрона. Добавьте дополнительные компоненты, необходимые для нормального культивирования интересующей клеточной линии.

Например, выращивают клеточную линию CMT 1 67 в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 1% раствора пенициллина стрептомицина. Перед использованием нагрейте среднюю температуру до 37 градусов Цельсия на водяной бане. Теперь приготовьте одну питательную среду Xcel.

Затем приготовьте 1%-ный благородный агар, добавив один грамм благородного агара в 100 миллилитров деионизированной воды. После этого приготовьте 0,6%-ный благородный агар, добавив 0,6 грамма благородного агара на 100 миллилитров деионизированной воды. Далее автоклавируйте благородные агаровые смеси.

Впоследствии сделайте один миллиграмм на миллилитр нитро синего тетра олеума хлорида стокового раствора в одном XPBS с целью окрашивания колоний. При этой процедуре разогрейте в микроволновой печи бутылку с 1%-ным благородным агаром в течение одной-двух минут, нагревая в микроволновой печи. Внимательно следите за раствором, чтобы не допустить выкипания.

Затем продолжайте нагревать и перемешивать с перерывами, пока агар полностью не растворится и раствор не станет прозрачным. После этого поместите растопленный раствор агара и подогрейте два х культуральную среду в ведро со льдом, наполненное 42 градусами Цельсия. Водопроводная вода.

Кроме того, поместите коническую трубку объемом 50 миллилитров в держатель трубки в ведро со льдом с горячей водой. Далее перенесите ведро в колпак для клеточных культур. Затем добавьте шесть миллилитров питательной среды и шесть миллилитров раствора благородного агара 1% в 50-миллилитровую коническую трубку.

Перемешайте пипеткой вверх и вниз несколько раз. Работа в быстром темпе предотвратит преждевременное затвердевание мягкого агара. После этого наберите примерно 5,5 миллилитров смеси с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки.

Дайте пузырькам воздуха подняться к верхней части колонки для пипеток. Затем влейте по 1,5 миллилитра смеси в каждую лунку и не допускайте отложения любых пузырьков воздуха. Накройте пластину крышкой и дайте агаровой смеси застыть в колпаке для клеточных культур при комнатной температуре в течение 30 минут.

Сначала соберите клетки с помощью трипсина и разведите их от одного до пяти в культуре в среде конической пробирки объемом 15 миллилитров. Подсчитайте клетки и рассчитайте количество клеток, необходимое в каждой лунке для приготовления окончательной клеточной суспензии в это время. Далее расплавить 0,6%-ный раствор агара в микроволновке.

Поместите его в ведро со льдом с горячей водой вместе с конической трубкой объемом 50 миллилитров в держателе трубки и окончательной суспензией клеток. Затем переложите ведро со льдом с растопленным 0,6%-ным агаром в колпак для клеточных культур для последующих действий. Для приготовления общего объема 12 миллилитров клеточной суспензии на шестилуночный планшет сначала пипеткой вносите шесть миллилитров клеточной суспензии в 50-миллилитровую коническую пробирку.

Затем добавьте в тюбик шесть миллилитров 0,6%агара. Поддерживайте температуру смеси при температуре 42 градуса Цельсия, чтобы избежать преждевременного затвердевания и максимизировать выживаемость клеток. После этого быстро пипетируйте смесь, два-три раза, чтобы распределить клетки.

Наберите 5,5 миллилитров смеси с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки и дайте пузырькам воздуха подняться на вершину колонки пипетки. Затем внесите в каждую по 1,5 миллилитра смеси. Хорошо дайте клеточной агаровой смеси застыть при комнатной температуре в колпаке для клеточных культур в течение 30 минут перед помещением ее в инкубатор для увлажненных клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия.

Добавляйте 100 микролитров питательной среды на верхний слой агара два раза в неделю, чтобы предотвратить высыхание, и дайте около 21 дня для достаточного образования колоний. Чтобы окрасить клетки, добавьте в каждую лунку по 200 микролитров раствора тетраоле хлорида нитро синего и выдержите пластину в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. После того, как колонии будут окрашены, сфотографируйте лунки с помощью тепловизора и подсчитайте колонии с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Здесь показан анализ образования колоний мягкого агара вектора, экспрессирующего CMT 1 67 LNCX LPC X клеток и CMT 1 67 LL на семь вьющихся девяти над экспрессирующими клетками. Вектор, экспрессирующий клетки CMT 1 67 L и CXL PC X и CMT 1 67 LL, стал на семь ф. Девять сверхэкспрессирующих клеток были покрыты в анализе образования колоний мягкого агара CMT 1 67 LL прошли семь запуганных девяти клеток, которые показали заметное снижение колониеобразования после его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области исследований рака к изучению клеточной трансформации in vitro. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценивать клетки на предмет самостоятельного роста по Анкориджу.