Очистка Native Комплексы для структурного исследования с использованием метода Tag Тандем Affinity

Общая цель данного протокола заключается в очистке нативного высокомолекулярного комплекса подходящего качества для биофизических исследований. Этот протокол служит не только способом очистки сложного, но и подробным руководством по оценке структурного качества образца при очистке. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он позволяет просто и быстро очищать нативную сборку в условиях, близких к физиологическим, чтобы обеспечить однородность состава.

После центрифугирования клеток S.cerevisiae и сцеживания надосадочной жидкости в соответствии с текстовым протоколом добавьте два миллилитра охлажденного буфера для лизиса и взбейте и/или используйте 10-миллилитровую сереологическую пипетку для суспендирования гранулы. Перенесите клеточную суспензию в пустую 50-миллилитровую коническую полипропиленовую центрифужную пробирку, хранящуюся на льду. Затем используйте дополнительные два миллилитра охлажденного буфера для лизиса, чтобы промыть каждую бутылку центрифуги и добавить раствор в 50-миллилитровую пробирку.

После определения влажного веса гранулы ячейки создайте ванну с жидким азотом в конической полипропиленовой центрифужной трубке объемом 50 миллилитров и вокруг нее. Далее наберите взвешенные клетки в пятимиллилитровый шприц и подсоедините к шприцу иглу 16 калибра. Затем заморозьте клеточную суспензию, пропустив ее через шприц и иглу в ванну со скоростью примерно один миллилитр в минуту для образования капель.

Чтобы лизировать дрожжевые клетки, начните с использования жидкого азота для предварительного охлаждения кофемолки. Затем добавьте до 40 грамм дрожжевых клеток и растирайте в течение 25 секунд, повторяя измельчение восемь или девять раз. Рекомендуется не очищать более 10 литров клеточной культуры за один раз.

Это сводит к минимуму время очистки и обеспечивает сохранение структурной целостности комплекса. После каждых двух раундов измельчения добавляйте в кофемолку неглубокий слой жидкого азота и дайте ему испариться. Чтобы предотвратить слипание клеток, предотвратите их оттаивание, используя охлаждаемый жидким азотом шпатель для перемешивания клеток.

После лизиса клетки должны выглядеть как мелкий белый порошок. После проверки лизиса клеток и приготовления буфера для лизиса с ингибиторами PMSF, DTT и протеазы в соответствии с текстовым протоколом с помощью охлажденного жидким азотом шпателя постепенно зачерпывают замороженный порошок лизированных клеток в подготовленные 50 миллилитровые пробирки буфера. С каждым добавленным шагом осторожно вращайте 50-миллилитровые пробирки при комнатной температуре, чтобы разморозить и растворить клетки и предотвратить образование пузырьков.

По мере того, как клетки растворяются, добавляйте еще клеточный порошок. После того, как все клетки были добавлены, продолжайте размораживать и растворять клетки до тех пор, пока в пробирках не останутся замороженные клеточные комки. Это должно занять примерно 50 минут.

Затем центрифугируйте клеточный лизат при температуре 25 000 g и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. После лизиса клеток и центрифугирования вы можете наблюдать небольшой темный слой в нерастворимой грануле. Перенесите надосадочную жидкость в поликарбонатные ультрацентрифужные пробирки и добавьте 10 микролитров 200 миллимолярных PMSF в каждую полную пробирку.

Центрифугируйте образцы при 100, 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение одного часа. В конце спина должны быть видны четыре слоя. Твердая прозрачная гранула, содержащая в основном рибосомальные комплексы; мягкая гранула, богатая липидами; большой, прозрачный слой с желтым оттенком, содержащий большую часть растворимых белков и комплексов клетки; и чешуйчатый верхний слой, состоящий из липидов.

В холодном помещении при температуре четыре градуса Цельсия используйте пипетку объемом в один миллилитр, чтобы удалить как можно больше верхнего чешуйчатого липидного слоя и выбросьте его. Используйте серологическую пипетку объемом 10 миллилитров, чтобы восстановить большую часть прозрачного желтого слоя. Затем, используя пипетку объемом в один миллилитр, чтобы не повредить два нижних слоя, восстановите последние несколько миллилитров этого слоя.

Из 40 граммов гранул с влажными клетками обычно извлекается примерно 48 миллилитров среднего слоя. После приготовления IgG-сефарозы по текстовому протоколу соедините смолу IgG с надосадочной жидкостью средней фазы и двумя таблетками мини-ингибитора протеазы на 40 грамм клеток. Затем поместите на вращатель при температуре четыре градуса Цельсия на два часа.

Это решение для периодического производства IgG. Подготовьте две 10-миллилитровые колонки из полипрепа, обрезав концы колонн, чтобы получить плоское отверстие. Налейте 24 миллилитра суспензии смолы IgG или раствора периодического действия в каждую колонну и дайте отстояться под действием силы тяжести.

Это соответствует 200 микролитрам упакованной смолы IgG. Если осаждение занимает более 30 минут, средняя фаза может быть загрязнена липидами. Когда осаждение будет завершено, используйте четыре последовательных объема по 10 миллилитров буфера IgG D150 для промывки насадочной колонны.

Для проведения расщепления вируса травления табака или протеазы TEV на колонке запечатайте дно колонки и добавьте один миллилитр буфера IgG D150 и 100 микролитров протеазы TEV. Запечатайте верхнюю часть колонны и с помощью термомиксера при 750 об/мин и 18 градусах Цельсия перемешивайте в течение 20 минут. Снова суспензируйте смолу и снова перемешайте в течение 20 минут.

Затем снова приостановите и повторите 20-минутное перемешивание в третий раз. Верните столбец на четыре градуса Цельсия и используйте гравитацию для элюирования белкового комплекса. Затем добавьте 200 микролитров IgG D150, чтобы размыть мертвый объем.

После приготовления смолы сродства кальмодулина в соответствии с текстовым протоколом добавьте буфер для связывания кальмодулина и образец в смолу и используйте вращатель пробирки для инкубации при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. Приготовьте двухмиллилитровую колонку полипрепа на 100 микролитров суспензии кальмодулина, разрезав конец колонны для создания плоского отверстия. В протоколе подробно описываются конкретные буферные и жилые объемы, выбранные таким образом, чтобы поддерживать концентрацию комплекса и свести к минимуму время пребывания смолы.

Если объем культуры изменяется, рекомендуется изменить смолу и буферные объемы гравитационных колонн с учетом этого изменения. Упакуйте колонку не более чем 100 микролитрами кальмодулиновой суспензии и под действием силы тяжести используйте 5 миллилитров буфера для связывания кальмодулина для трехкратной промывки смолы. Используя 200 микролитров буфера для элюирования кальмодулина, разбавьте белок в три раза.

Затем запечатайте дно колонки и добавьте 20 микролитров элюирующего буфера и инкубируйте в течение 2,5 минут, прежде чем выпустить уплотнение и дать белку вымыться под действием силы тяжести. Снова запечатайте нижнюю часть колонки и добавьте 200 микролитров элюирующего буфера перед инкубацией в течение пяти минут. Затем распечатайте нижнюю часть колонны и вымойте раствор.

Для шестого и последнего элюирования запечатайте дно колонки и инкубируйте с элюирующим буфером в течение 10 минут. Затем распечатайте и разбавьте. Проведите анализ после очистки и храните образцы в соответствии с текстовым протоколом.

Как показано на рисунке, первоначальная очистка комплекса методом TAP в соответствии с опубликованным протоколом привела к образованию комплекса, который мигрировал в виде трех полос на окрашенном серебром геле. Многократные раунды оптимизации метода TAP дают нам комплекс, который мигрировал в виде одной полосы на нативном геле, что свидетельствует о более однородной сборке. В соответствии с результатом нативного геля, вестерн-блоттинг с использованием антитела TAP против комплекса, очищенного в соответствии с опубликованным протоколом, обнаружил протеолиз меченного TAP белка SNU-71.

Модификации метода TAP значительно сократили объем протеолиза, так как почти все из 17 белков в комплексе U1 snRNP были разрешены с помощью SDS-PAGE и положительно идентифицированы с помощью мультимасс-спектрометрии. Электронная микроскопия с отрицательным окрашиванием показывает монодисперсные частицы от успешной очистки после первого и второго этапов TAP. В отличие от этого, при неудачной очистке не наблюдается частиц правильного размера.

Итоговое комплексное качество оценивали на газоне из очищенных частиц, показанных здесь, которые кажутся монодисперсными на негативном изображении ЭМ необработанного изображения. Кроме того, средние классовые значения частиц выявляют отличительные особенности, указывающие на то, что образец, возможно, пригоден для структурного исследования. После освоения этот протокол может быть завершен в течение 10-12 часов после размораживания замороженного порошка лизированных клеток.

Следуя этому протоколу, важно убедиться, что все растворы не содержат протеаз и нуклеаз, а также быстро работать для предотвращения агрегации или диссоциации комплекса. Посмотрев это видео, вы должны понять, как очистить родной комплекс подходящего качества для структурного исследования, а также как оценить, что это было достигнуто.