Очистка Native Комплексы для структурного исследования с использованием метода Tag Тандем Affinity

Общая цель данного протокола заключается в очистке нативного макромолекулярного комплекса подходящего качества для биофизических исследований. Этот протокол служит не только способом очистки комплекса, но и подробным руководством по оценке структурного качества образца в процессе очистки. Основным преимуществом данного протокола является то, что он позволяет просто и быстро очищать нативную сборку в условиях, близких к физиологическим, что обеспечивает композиционную гомогенность.

После центрифугирования клеток S.cerevisiae и сливания супернатанта согласно текстовому протоколу добавьте два миллилитра охлажденного лизирующего буфера, затем перемешайте содержимое круговыми движениями и/или используйте серологическую пипетку объемом 10 миллилитров для ресуспендирования осадка. Перенесите суспензию клеток в пустую коническую полипропиленовую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, находящуюся на льду. Затем используйте дополнительные два миллилитра охлажденного лизирующего буфера для промывки каждой центрифужной пробирки и добавьте полученный раствор в пробирку объемом 50 миллилитров.

После определения влажного веса клеточного осадка создайте баню с жидким азотом в 50 мл конической полипропиленовой центрифужной пробирке и вокруг нее. Затем наберите суспендированные клетки в шприц объемом 5 мл и подсоедините к шприцу иглу калибра 16. После этого заморозьте клеточную суспензию, пропуская ее через шприц и иглу в баню со скоростью примерно 1 мл в минуту для образования капель.

Для лизиса дрожжевых клеток сначала предварительно охладите кофемолку с помощью жидкого азота. Затем добавьте до 40 г дрожжевых клеток и измельчайте в течение 25 секунд, повторив процедуру измельчения восемь или девять раз. Рекомендуется не проводить очистку более чем для 10 л клеточной культуры за один раз.

Это позволяет сократить время очистки и гарантирует сохранение структурной целостности комплекса. Через каждые два цикла измельчения добавляйте в ступку небольшой слой жидкого азота и давайте ему испариться. Чтобы предотвратить слипание клеток, не допускайте их оттаивания, перемешивая клетки шпателем, охлажденным в жидком азоте.

После лизиса клетки должны выглядеть как мелкий белый порошок. Проверив лизис клеток и подготовив лизирующий буфер с PMSF, DTT и ингибиторами протеаз согласно текстовому протоколу, с помощью шпателя, охлажденного в жидком азоте, порциями перенесите замороженный порошок лизированных клеток в подготовленные пробирки объемом 50 мл с буфером. После добавления каждой порции осторожно вращайте пробирки объемом 50 мл при комнатной температуре, чтобы разморозить и растворить клетки, а также предотвратить образование пузырьков.

По мере растворения клеток добавляйте новую порцию порошка из клеток. После добавления всех клеток продолжайте размораживание и растворение до тех пор, пока в пробирках не перестанут наблюдаться замороженные комки клеток. Этот процесс должен занять примерно 50 минут.

Затем центрифугируйте клеточный лизат при 25 000 ×g и температуре 4 °C в течение 20 минут. После лизиса клеток и центрифугирования в нерастворимом осадке может наблюдаться небольшой темный слой. Перенесите супернатант в поликарбонатные пробирки для ультрацентрифугирования и добавьте по 10 µL 200 мМ PMSF в каждую заполненную пробирку.

Центрифугируйте образцы при 100 000 ×g и температуре 4 °C в течение одного часа. По окончании центрифугирования должны быть видны четыре слоя: плотный прозрачный осадок, состоящий преимущественно из рибосомальных комплексов; мягкий осадок, богатый липидами; обширный прозрачный слой с желтоватым оттенком, содержащий большинство растворимых белков и комплексов клетки; и чешуйчатый верхний слой, состоящий из липидов.

В помещении с контролируемой температурой при 4 °C с помощью дозатора на 1 мл удалите как можно больше верхнего чешуйчатого липидного слоя и утилизируйте его. С помощью серологической пипетки на 10 мл соберите большую часть прозрачного желтого слоя. Затем, используя дозатор на 1 мл, чтобы не потревожить два нижних слоя, соберите оставшиеся несколько миллилитров этого слоя.

Из 40 граммов влажного осадка клеток обычно извлекают примерно 48 миллилитров среднего слоя. После подготовки сефарозы IgG согласно текстовому протоколу смешайте смолу IgG с супернатантом средней фазы и двумя мини-таблетками ингибитора протеаз на 40 граммов клеток. Затем поместите смесь на ротатор при температуре 4 °C на два часа.

Это раствор IgG для серийной очистки. Подготовьте две полипреп-колонки объемом 10 мл, обрезав концы колонок для создания плоского отверстия. Налейте по 24 мл суспензии смолы IgG или раствора для серийной очистки в каждую колонку и дайте им осесть под действием силы тяжести.

Это соответствует 200 µL упакованной смолы с IgG. Если седиментация занимает более 30 минут, это может указывать на загрязнение средней фазы липидами. После завершения седиментации промойте упакованную колонку четырьмя последовательными порциями буфера IgG D150 объемом по 10 mL.

Для проведения расщепления протеазой табачного вируса вытравливания (TEV-протеазой) непосредственно на колонке герметично закройте нижнюю часть колонки, добавьте 1 ml буфера IgG D150 и 100 µL TEV-протеазы. Герметично закройте верхнюю часть колонки и перемешивайте смесь в течение 20 минут с помощью термомиксера при 750 RPM и 18 °C. Ресуспендируйте смолу и повторно перемешивайте в течение 20 минут.

Затем повторно ресуспендируйте образец и в третий раз перемешайте в течение 20 минут. Верните колонку при температуре 4 °C и проведите элюцию белкового комплекса под действием силы тяжести. Затем добавьте 200 µL IgG D150 для элюции мертвого объема.

После подготовки аффинной смолы с кальмодулином согласно текстовому протоколу добавьте к смоле связывающий буфер для кальмодулина и образец, затем инкубируйте смесь в течение одного часа при температуре 4 °C с помощью ротатора для пробирок. Подготовьте колонку PolyPrep объемом 2 мл на каждые 100 µL суспензии кальмодулина, отрезав конец колонки для создания плоского отверстия. В протоколе указаны конкретные объемы буфера и время пребывания в смоле, выбранные таким образом, чтобы поддерживать высокую концентрацию комплекса и минимизировать время его нахождения в смоле.

При изменении объема культуры рекомендуется пропорционально изменить объем смолы и буфера в гравитационных колонках. Заполните колонку не более чем 100 microliters суспензии кальмодулина и под действием силы тяжести трижды промойте смолу, используя 5 milliliters буфера для связывания кальмодулина. Элюируйте белок трижды, используя по 200 microliters буфера для элюции кальмодулина.

Затем закройте нижнее отверстие колонки, добавьте 20 µL элюирующего буфера и инкубируйте в течение 2,5 минут, после чего откройте отверстие и дайте белку элюироваться под действием силы тяжести. Снова закройте нижнее отверстие колонки, добавьте 200 µL элюирующего буфера и инкубируйте в течение пяти минут. Затем откройте нижнее отверстие колонки и соберите элюат.

Для шестой и заключительной элюции закройте нижнюю часть колонки и инкубируйте с элюирующим буфером в течение 10 минут. Затем откройте колонку и проведите элюцию. Выполните анализ после очистки и сохраните образцы в соответствии с текстовым протоколом.

Как показано здесь, первичная TAP-очистка комплекса по опубликованному протоколу привела к получению продукта, который мигрировал в виде трех полос на геле с окрашиванием серебром. Многократная оптимизация метода TAP позволила получить комплекс, мигрирующий в виде одной полосы в нативном геле, что свидетельствует о более гомогенной сборке. В соответствии с результатом нативного геля, вестерн-блоттинг с использованием антител к TAP-метке комплекса, очищенного по опубликованному протоколу, выявил протеолиз TAP-меченого белка SNU-71.

Модификации метода TAP значительно снизили степень протеолиза, так как почти все 17 белков комплекса U1 snRNP были разделены с помощью SDS-PAGE и достоверно идентифицированы методом многократной масс-спектрометрии. Электронная микроскопия с отрицательным контрастированием демонстрирует монодисперсные частицы после успешной очистки на первом и втором этапах TAP. Напротив, при неудачной очистке частиц правильного размера не наблюдается.

Качество итогового комплекса оценивали по слою очищенных частиц, показанных здесь, которые выглядят монодисперсными на исходном ПЭМ-изображении с негативным контрастированием. Кроме того, усреднение классов частиц выявило отчетливые признаки, указывающие на то, что образец, вероятно, пригоден для структурных исследований. После освоения данный протокол может быть выполнен в течение 10–12 часов после размораживания порошка замороженного лизата клеток.

При выполнении данного протокола важно убедиться, что все растворы не содержат протеаз и нуклеаз, а также работать быстро, чтобы предотвратить агрегацию или диссоциацию комплекса. После просмотра этого видео вы должны понять, как очистить нативный комплекс подходящего качества для структурных исследований, а также как оценить достижение этого результата.