Визуальное стромул Частота с флуоресцентной микроскопией

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации и определении частоты стромул с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии живых клеток в листьях, а также для визуализации стром in vitro с использованием хлоропластов, извлеченных из листьев. Эти экспериментальные методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии растительных клеток и исследований хлоропластов, обнаружив, как функционируют стромулы. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они позволяют получать воспроизводимые и надежные данные, даже об этих высокодинамичных структурах хлоропластов.

У нас возникла идея исследования по выделению хлоропластов, потому что некоторые исследования показали, что для образования стропул требуются цитозольные структуры, такие как цитоскелет. Поэтому мы решили смешать клетку и посмотреть, могут ли стромулы все еще образовываться. Чтобы подготовить образцы листьев, начните с того, что с помощью очень острого лезвия бритвы отрежьте небольшую часть листа Nicotiana benthamiana.

Сразу после срезания листовой части погрузите ее в пятимиллилитровый шприц, наполненный водой. Затем удалите воздух из шприца и примените вакуум, закрыв пальцем отверстие шприца, прежде чем тянуть поршень. Осторожно отпустите поршень, чтобы не повредить часть листа.

Затем повторите удаление воздуха два или три раза, или пока воздух не будет удален, и лист не станет темно-зеленым. Добавьте каплю воды на предметное стекло и поместите на него листовую секцию. Затем добавьте еще каплю воды на верх листа, и добавьте покровный лист.

Если есть пузырьки воздуха, осторожно постучите по крышечному тексу, пока они не будут удалены. С помощью проходящего света и 20-кратного объектива сфокусируйтесь на поле зрения вблизи центра участка листа, визуализируя несколько хлоропластов одновременно. Сохраните изображение с проходящим светом, чтобы при необходимости можно было различить типы ячеек позже.

Затем переключитесь на лазерное освещение с соответствующими фильтрами возбуждения и излучения для используемого флуорофора и сохраните еще одно изображение. С помощью программного обеспечения микроскопа выберите канал GFP и нажмите, чтобы отрегулировать апертуру точечного отверстия на одну воздушную единицу. Выберите лазерное сканирование, чтобы начать визуализацию образца, а затем нажмите на канал GFP и усиление детектора, чтобы свести к минимуму мощность лазера, сохраняя при этом четкую визуализацию стромул.

Затем подготовьте эксперимент с Z-стеком, в котором будет собрана серия изображений через эпидермис листа в поле зрения. При необходимости отрегулируйте скорость сканирования и разрешение изображения, чтобы обеспечить быстрый сбор Z-стека. Затем сохраните стек Z для последующего анализа.

Используя изображение J, объедините стек Z в одно изображение, используя максимальную интенсивность, указанную в программном обеспечении. Затем определите и вручную подсчитайте все хлоропласты на изображении. Для каждого хлоропласта визуально определите, виден ли один или несколько стромул, выходящих из хлоропласта, на объединенном изображении Z-стека.

Чтобы извлечь неповрежденные хлоропласты, приготовьте буфер холодной экстракции с использованием следующих реагентов. Затем с помощью NaOH и HCl отрегулируйте pH до 6,9 и поставьте в холодильник перед использованием. Приготовьте изоляционный буфер и отрегулируйте pH до 7,6.

Если листья не экспрессируют генетически кодируемый стромфуорофор, приготовьте раствор карбоксифлуоресцеина диацетата или CFDA. Чтобы изолировать хлоропласты, удалите примерно от 5 до 10 граммов листьев с нескольких растений и кратковременно промойте в холодной воде. Затем сразу же переложите листья в 50 миллилитров холодного экстракционного буфера.

С помощью блендера с несколькими короткими импульсами измельчите листья, затем профильтруйте смесь через два-три слоя марлевой салфетки, чтобы удалить остатки листьев. Разделите извлеченный хлоропласт на две центрифужные пробирки по 50 миллилитров и центрифугируйте в течение одной минуты при давлении 750 х г. Выбросьте надосадочную жидкость и используйте 10 миллиметров изоляционного буфера для повторного суспендирования зеленых хлоропластов.

Затем снова центрифугируйте в течение одной минуты при 750 x g, выбросьте надосадочную жидкость и используйте изоляционный буфер для повторного суспендирования хлоропластов до конечного объема в пять миллилитров. Если хлоропласты получены из трансгенных растений, экспрессирующих пластидно-целевые флуоресцентные белки, перенесите 20 микролитров хлоропластов на предметное стекло и добавьте покровное стекло. Затем проводят микроскопию.

Чтобы окрашивать хлоропласты растений, которые не экспрессируют пластид-целевые флуоресцентные белки, добавьте пять микролитров 50 миллимолярного запаса CFDA к пяти миллилитрам хлоропластов в изоляционном буфере. Дав хлоропластам поинкубироваться в течение пяти минут, переложите небольшую аликвоту на предметное стекло, добавьте покровный листок и проведите микроскопию. Наконец, используйте набор фильтров FITC или GFP и 20-кратный объектив для одновременной визуализации нескольких хлоропластов.

Или более высокая цель — визуализация одного изолированного хлоропласта. Здесь показана объединенная стопка, показывающая частоту столбиков GFP в помиловании молодых сеянцев N.Benthamiana. На этой панели изображение было денасыщенным и инвертированным так, что строма кажется черной.

Хлоропласты были помечены как не имеющие стромулов или имеющие по крайней мере одну стромлю. Из 87 визуализированных эпидермальных хлоропластов 33 имеют стромулы, с частотой 37,9 процента в этом листе. Этот график представляет собой анализ более 23 000 хлоропластов и нескольких сотен клеток из одного листа 21 различных растений.

Средняя частота стромулей в течение дня составила 20,8 плюс-минус 1,8 процента, а средняя частота ночных стромулов составила 12,8 плюс-минус 0,9 процента, что указывает на значительно более высокую дневную частоту, как было определено с помощью теста Уэлча Т. На этом рисунке стромулы хлоропластов наблюдались in vitro после выделения из N.benthamiana, экспрессирующей пластидно-целевой GFP, или после использования CFDA для окрашивания хлоропластов N.benthamiana, или Spinachia oleracea. При проведении визуализации стром в живых клетках важно работать быстро и как можно меньше манипулировать тканями растения.

После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как подавление экспрессии генов или химическая обработка, для обнаружения дополнительных молекулярных игроков или путей, участвующих в формировании и функционировании стромул. Этот метод был использован исследователями в области клеточной биологии растений и иммунитета растений для изучения роли стромол в клеточных сигнальных путях и реакциях растений на патогены. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как рассчитать частоту стромолей в листе и как наблюдать за стромулами в экстрагированных хлоропластах.

И помните, что лазеры и электрическое напряжение, питающее сканирующий электронный конфокальный микроскоп, могут быть чрезвычайно опасными, и важно понимать системные требования для использования этого оборудования.