Биоинжиниринг гуманизированных микроуровней костного мозга в мышах и их визуализация с помощью Live Imaging

Общая цель данного метода заключается в имплантации каркасов-носителей человеческих клеток мышам для создания гуманизированных ниш костного мозга с последующей визуализацией поведения человеческих клеток внутри имплантатов в режиме реального времени. Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы в области гематопоэза человека, поскольку он позволяет воспроизводить и визуализировать в режиме реального времени с одноклеточным разрешением различные компоненты костного мозга. Одним из основных преимуществ данной системы является ее универсальность, так как она позволяет имплантировать различные компоненты ниши по отдельности или в комбинации.

Данную методологию потенциально можно применить в других областях исследований, таких как изучение метастазирования опухолей или скрининг лекарственных препаратов. Соблюдая надлежащую технику стерильности, нарежьте стерилизованную желатиновую губку на 24 фрагмента примерно одинакового размера. Реконструируйте желатиновые каркасы путем погружения в этанол, а затем в PBS.

Затем аккуратно промокните каждый скаффолд стерильной салфеткой, чтобы удалить излишки жидкости, и перенесите скаффолды в отдельные лунки 24-луночного планшета с ультранизкой адгезией. С помощью инсулинового шприца осторожно введите от 1 × 10⁵ до 1 × 10⁶ стромальных клеток в 50 µL культуральной среды в каждый скаффолд и поместите планшет в инкубатор для культур клеток. При введении клеток в скаффолд убедитесь в отсутствии утечек из него.

Через один час заполните каждую лунку тремя миллилитрами свежей питательной среды для культур клеток и верните скаффолды в инкубатор. Через 24 часа введите в скаффолды 1 × 10⁵ гемопоэтических клеток, после чего проведите инкубацию, повторно добавьте среду и выдержите в инкубаторе в течение 24 часов, как было продемонстрировано ранее. Для создания скаффолдов-носителей рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека поместите реконструированные скаффолды в отдельные лунки 96-луночного планшета с U-образным дном и добавьте по пять микролитров рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 к каждому скаффолду.

Затем покройте скаффолды 20 µL тромбина и 20 µL фибриногена. Для хирургической имплантации биоинженерных скаффолдов сначала выбрейте область операции на спине экспериментальной мыши и с помощью ватного тампона, смоченного в разведенном хлоргексидине, трижды очистите открытую поверхность кожи в каждом направлении. Затем с помощью стерильного пинцета и скальпеля сделайте разрез кожи длиной от 0,5 до 0,7 см в направлении спереди назад и введите пинцет под подкожную ткань для формирования кармана.

Введите скаффолд глубоко в карман и закройте разрез хирургическим клеем. Оставьте имплантированные скаффолды для развития на срок от восьми до 24 недель до момента эксплантации. После внутривенного введения флуоресцентных веществ и эвтаназии животных простерилизуйте кожу, как было показано ранее, и сделайте продольный разрез кожи на спине животного, рядом с первоначальным местом имплантации.

Осторожно отделите кожу от подкожного кармана, в который был имплантирован скаффолд, затем с помощью пинцета аккуратно захватите скаффолд и осторожно разрежьте остатки мембраны и тканей вокруг него, чтобы извлечь структуру. Используйте быстросохнущий клей для фиксации скаффолда в чашке Петри объемом 35 x 10 мл. Для скаффолдов с костным морфогенетическим белком 2 перед заполнением чашки PBS используйте хирурмический микродрель под микрохирургическим микроскопом, чтобы истончить поверхность кости, обеспечив визуализацию флуорофоров и получение изображений с высоким разрешением.

Будьте особенно осторожны во время сверления, так как толщина кости обычно варьируется между скаффолдами, и важно не повредить поверхность. Заполните чашку PBS комнатной температуры. Для двухфотонной микроскопии биоинженерных скаффолдов поместите скаффолд на предметный столик конфокального микроскопа и выберите объектив с увеличением 20x и NA 1,0 для погружения в воду.

Затем в режиме сбора данных программного обеспечения для визуализации отметьте поле «показывать инструменты ручного управления». В меню лазера включите двухфотонный лазер, дайте ему прогреться и стабилизироваться. Когда лазер будет готов, в меню настроек визуализации активируйте режим каналов и выберите функцию переключения дорожки в каждом кадре.

В меню пути светового луча (light path) выберите режим без десканирования (non descanned) и главный светоделитель MBS 760 plus. Активируйте четыре детектора без десканирования и установите конфигурацию, как показано на схеме. В меню каналов установите длину волны лазера 890 nanometers, а мощность — 50%. Установите общий коэффициент усиления (gain master) в диапазоне от 500 до 600, цифровой сдвиг (digital offset) на ноль, а цифровое усиление (digital gain) на 15 для каждого канала.

В режиме сбора данных установите соответствующие параметры для получения изображений высокого разрешения, чтобы избежать повреждения ткани и выцветания флуорофоров. Затем установите увеличение (zoom) на единицу для первичного сканирования изображения. После настройки всех параметров опустите объектив до соприкосновения с физиологическим раствором и вручную настройте фокус объектива, используя лампу в качестве источника света.

Теперь активируйте меню Z-stack и выберите функцию first last. Установите необходимый интервал между двумя последовательными срезами и выберите режим live для сканирования образца в реальном времени, при необходимости отрегулировав цифровой коэффициент усиления (digital gain) и цифровой сдвиг (digital offset) для получения оптимальной экспозиции. Чтобы визуализировать несколько каналов одновременно, выберите функцию split.

В меню предметного столика, находясь в режиме реального времени, просканируйте изображение и отметьте области интереса, например, расположение костных полостей. После завершения сканирования образца перейдите к первой области интереса и с помощью функций «set first» и «set last» в режиме реального времени установите верхнюю и нижнюю границы 3D Z-стека, охватывающего область интереса. Затем установите центр, C, и нажмите кнопку «start experiment», чтобы начать сбор Z-стек изображений данной области интереса.

После завершения сбора данных сохраните изображения в соответствующей папке и просканируйте следующую область интереса. На этих репрезентативных изображениях можно наблюдать общую морфологию различных скаффолдов, извлеченных из иммунодефицитных мышей NSG через восемь недель после имплантации. Совместный посев с эндотелиальными клетками человека увеличивает васкуляризацию скаффолда, тогда как добавление рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека индуцирует образование кости.

Эти скаффолды, визуализированные с помощью двухфотонной микроскопии живых объектов, демонстрируют наличие кровеносных сосудов в скаффолдах и долгосрочное приживление человеческих гемопоэтических клеток в паренхиме скаффолда. Скаффолды, заселенные человеческими эндотелиальными клетками и мезенхимальными стромальными клетками, иллюстрируют участие человеческих эндотелиальных клеток в формировании сосудов внутри скаффолда, что приводит к созданию мышино-человеческой химерной сосудистой сети. С помощью двухфотонной микроскопии можно визуализировать формирование костной ткани, а также образование полостей в гуманизированной сосудистой сети в эндостальной ткани, которая в значительной степени напоминает эндостальную ткань костного мозга.

Кроме того, в каркасах-носителях с рекомбинантным костным морфогенетическим белком 2 человека морфология ткани внутри каркаса напоминает зрелый костный мозг с жировой тканью, что позволяет предположить, что мезенхимальные стромальные клетки человека также способствуют формированию жировой ткани. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о всех методах биоинженерии и основных мышиных каркасах. Всегда помните о необходимости соблюдения стерильности среды и будьте предельно осторожны при работе с каркасами.

Учитывайте ограничения, связанные с данным методом, такие как образование химер тканей человека и мыши. Помните, что после визуализации образцы можно использовать для дальнейших исследований, поскольку скаффолды можно подвергнуть перевариванию и, таким образом, выделить из них живые клетки.