Биоинжиниринг гуманизированных микроуровней костного мозга в мышах и их визуализация с помощью Live Imaging

Общая цель этого метода заключается в имплантации каркасов человеческих клеток мышам для создания гуманизированных ниш костного мозга, а затем в реальном времени наблюдать за поведением человеческих клеток внутри имплантатов. Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы в области гемопоэза человека, поскольку позволяет воспроизводить и получать живое изображение с разрешением одной клетки различных компонентов костного мозга. Универсальность этой системы является одним из ее главных преимуществ, так как она позволяет имплантировать различные нишевые компоненты по одному или в комбинации.

Эта методология потенциально может быть применена в других областях исследований, таких как метастазирование опухоли или скрининговые исследования лекарств. Используя соответствующую стерильную технику, начните с разрезания стерилизованной желатиновой губки на 24 кусочка одинакового размера. Восстановите желатиновые каркасы путем погружения в этанол, а затем в PBS.

Затем аккуратно промокните каждый каркас на стерильной ткани, чтобы удалить лишнюю жидкость, и перенесите каркасы в отдельные лунки сверхнизкой прикрепленной 24-луночной пластины. С помощью инсулинового шприца осторожно ввести один раз от 10 до 10 до 10 до 10 до 6 стромальных клеток в 50 микролитров питательной среды в каждый каркас и поместить планшет в инкубатор для клеточных культур. При введении клеток в каркас убедитесь, что из каркаса не происходит утечки.

Через час заполните каждую лунку тремя миллилитрами свежей среды для клеточных культур и верните скаффолды в инкубатор. Через 24 часа введите один раз от 10 до пятого гемопоэтических клеток в каркасы, после чего следует инкубация с дальнейшим добавлением среды, а также 24-часовая инкубация, как показано выше. Для получения рекомбинантного морфогенетического белка кости человека двух скаффолдов-носителей поместите восстановленные каркасы в отдельные лунки 96-луночной пластины с U-образным дном и добавьте пять микролитров рекомбинантного морфогенетического белка кости человека по два к каждому каркасу.

Затем накройте каркасы 20 микролитрами тромбина и 20 микролитрами фибриногена. Для хирургической имплантации биоинженерных скаффолдов сначала побрейте операционную область на спине экспериментальной мыши, а затем используйте ватную палочку, смоченную в разведенном хлоргексидине, чтобы очистить открытую поверхность кожи три раза в каждом направлении. Затем с помощью стерильных щипцов и скальпеля сделайте разрез на коже на расстоянии от 0,5 до 0,7 сантиметра спереди и сзади, и вставьте щипцы под подкожную клетчатку, чтобы сделать карман.

Вставьте скаффолт глубоко в карман, а разрез закройте хирургическим клеем. Дайте имплантированным каркасам развиться в течение восьми-24 недель до экспланта. После внутривенного введения флуоресцентных веществ и усыпления животных необходимо простерилизовать кожу, как показано выше, и сделать продольный разрез кожи на спине животного, рядом с первоначальным местом имплантации.

Осторожно отделите кожу от подкожного кармана, в который был имплантирован каркас, затем с помощью пинцета аккуратно возьмитесь за каркас и осторожно разрежьте остаточную мембрану и ткани, окружающие каркас, чтобы восстановить структуру. Используйте быстродействующий клей, чтобы закрепить строительные леса к чашке Петри размером 35 на 10 миллилитров. Для двух каркасов костного морфогенетического белка, прежде чем заполнить пластину PBS, используйте хирургическую микродрель под микрохирургическим микроскопом для истончения поверхности кости, что позволяет визуализировать флуорофоры и получать изображения с высоким разрешением.

Будьте особенно осторожны в процессе сверления, потому что толщина кости обычно варьируется в зависимости от каркаса, и важно не сломать поверхность. Наполните блюдо ПБС комнатной температуры. Для получения изображений биоинженерных каркасов с помощью 2-фотонной микроскопии поместите каркас на предметный столик конфокального микроскопа и выберите водную иммерсионную линзу с яркостью 20 раз 1,0 NA.

Затем в режиме сбора данных программного обеспечения для обработки изображений выберите поле «Показать ручные инструменты». В меню лазера включите 2-фотонный лазер и дайте лазеру нагреться и стабилизироваться. Когда лазер будет готов, в меню настройки изображения активируйте режим канала и переключайте дорожку для каждого кадра.

В меню светового пути выберите неразсканированный и дальний свет светоделителя MBS 760 plus. Активируйте четыре детектора, не подлежащих сканированию, и установите конфигурацию, как показано на схеме. В меню каналов установите длину волны лазера на 890 нанометров и мощность на 50%Установите мастер-коэффициент усиления на 500–600, цифровое смещение — на ноль, а цифровое усиление — на 15 для каждого канала.

В режиме получения данных задайте соответствующие параметры для получения изображений с высоким разрешением без повреждения тканей и отбеливания флуорофоров. Затем установите зум на единицу для первоначального сканирования изображения. Когда все параметры будут установлены, опустите линзу до тех пор, пока она не коснется солевого раствора, и вручную установите фокусировку линзы, используя лампу в качестве источника света.

Теперь активируйте меню Z-stack и выберите первую последнюю функцию. Установите необходимый интервал между двумя последовательными срезами и выберите Live для отображения сканирования образца в реальном времени, регулируя цифровое усиление и цифровое смещение по мере необходимости для оптимальной экспозиции. Чтобы визуализировать несколько каналов одновременно, выберите функцию разделения.

В меню рабочей области, находясь в режиме реального времени, отсканируйте изображение и отметьте интересующие области, такие как расположение костных полостей. Когда сканирование образца будет завершено, перейдите к первой области интереса и используйте функции «Установить первым» и «Установить последний» в режиме реального времени, чтобы установить верхнюю и нижнюю части 3D-стека Z, окружающих область интереса. Затем установите центральную точку C и нажмите кнопку «Начать эксперимент», чтобы начать получение изображения Z-стека в интересующей области.

Когда сбор данных будет завершен, сохраните изображения в указанной папке и отсканируйте следующую интересующую область. На этих репрезентативных изображениях можно наблюдать общую морфологию различных скаффолдов, полученных от иммунодефицитных мышей NSG через восемь недель после имплантации. Совместное посев с эндотелиальными клетками человека увеличивает васкуляризацию каркаса, в то время как добавление рекомбинантного морфогенетического белка кости человека 2 индуцирует формирование кости.

Эти скаффолды, визуализированные с помощью 2-фотонной микроскопии в реальном времени, показывают наличие кровеносных сосудов в каркасах и долгосрочное приживление гемопоэтических клеток человека в паренхиме каркаса. Скаффолды, засеянные эндотелиальными и мезенхимальными стромальными клетками человека, иллюстрируют участие эндотелиальных клеток человека в формировании сосудов внутри каркаса, что приводит к образованию мышечно-человеческой химериальной сосудистой сети. Формирование костной ткани может быть визуализировано с помощью 2-фотонной микроскопии, а также образование полостей в гуманизированной сосудистой сети в эндостальной ткани, которая очень напоминает эндостальную ткань костного мозга.

Кроме того, в рекомбинантном костном морфогенетическом белке человека с двумя несущими каркасами морфология ткани внутри каркаса напоминает зрелый костный мозг с жировой тканью, что позволяет предположить, что мезенхимальные стромальные клетки человека также вносят свой вклад в формирование жировой ткани. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление обо всех биоинженерах и основных мышиных каркасах. Всегда помните о поддержании аскетической среды и будьте особенно осторожны при обращении с лесами.

Имейте в виду ограничения, связанные с этим методом, такие как химеры тканей человека и мыши. Помните, что после визуализации образцы могут быть использованы для дальнейших исследований, так как скаффолды могут быть переварены, а значит, из них можно извлечь живые клетки.