繁殖と離乳の基本

Lab Animal Research

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Overview

ソース: ケイ ・ スチュワート、RLATG、RVT CMAR;ヴァレリー A. シュレーダー、RVT、RLATG。ノートルダムのノートルダム大学

マウスおよびラットの何百万人が毎年生物医学研究で使用するため育てています。世界中で、またマウスおよびラット社内リサーチのオプションを増加コストを減らすために、繁殖、供給マウス研究所に多くの施設を選択するいくつかの大規模な商業繁殖施設が集まっています。動物施設で繁殖、研究者が研究のニーズを満たすために、胚と必要に応じて新生児妊娠の時間、動物の遺伝学を操作することがあります。

マウスやラットは、様々 な工夫と方法で飼育することができます。膣細胞診、膣の領域の可視化と交尾プラグの観察の使用などの技術的な手順は、研究の要件に対応する繁殖の同期を支援するために開発されています。本稿では、マウス ・ ラット飼育使用技術的な手順の基本的なファンダメンタルズの概要です。参照のリストには繁殖を複雑なスキームの詳細な説明と膣細胞診の方法の完全な説明があります。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. ラボ動物研究の必需品. 繁殖と離乳の基本. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

Principles

株と株の一般的な種類

マウスおよびラットはザイモグラムの株式, 近交系、ハイブリッド菌株と飼育された一般的です。家畜同様の特性がまだ遺伝的に同一ではないです。彼らはランダムにヘテロ接合性または遺伝的差異を維持するために繁殖しました。対照的に、近交系動物は少なくとも 20 代の兄弟姉妹や親子の交配に交配されて、遺伝子ホモ接合体です。最後に、ハイブリッド動物が 2 系統の交配の子孫であります。

繁殖行動に影響を与える要因

マウスおよびラットの繁殖特性に影響を与えることができる多くの要因があります。女性ブリーダーの活力は、近親交配のレベルによって大きく異なります。ザイモグラムがいる動物のより丈夫より積極的なより大きくより強力な仔を出すため。C57bl/6 マウスなどのいくつかの一般的に使用される系統繁殖を妨げることができる積極的な行動が表示されます。積極的なひずみを繁殖、すべてリットル必要があります密接に見ていた。積極的な子犬を含むごみから動物を繁殖のため使用しないでください。温度・湿度・照明変動の減少を引き起こすことができます効率を繁殖。騒音や飼育室内振動は、有害な影響を引き起こすことも示されています。繁殖施設内でこれらの変数のコントロールは、いくつかの効果を最小化されます。1遺伝の修正を持つ動物はより少なく丈夫な肥沃ながちで前に、または出生後すぐに子犬の致死突然変異のいくつか発生可能性があります。

再生産表式

再生産表式はマウスおよびラットに似ています。一般的に使用されるシステムは、1 人の女性が男性 1 人に飼育された男性または一夫多妻の交尾 2 つ以上の女性に飼育の一夫一婦制交配です。雌マウスとラットの両方が polyestrous と産後発情約 20-24 h を受ける分娩後。分娩後の発情中女性はごみを考えることができます。遺伝的突然変異のため寿命が短い繁殖のラットやマウスの系統、ケージに女性と男性のままに彼女はすぐに別のゴミを考えることができるようにする一般的です。彼女は継続的に授乳を温めては、この集中的な繁殖計画が、女性にストレスになることですができます。Nonintensive 方式は、彼女が目に見えて妊娠して女性の分離を含む彼女はオスのケージに彼女のくずが乳離れするまで返されません。このシステムは、はるかに少ない女性に厳しいです。

遺伝子操作目的の繁殖

遺伝子組み換え動物 (コードギアス) は、遺伝子、ゲノムや遺伝子導入動物のゲノムに追加されます別の種からの遺伝子を持っていることから削除を持っているどちらかのノックアウト動物です。コードギアス近交系として繁殖する、および頻繁に非常に具体的な研究プロジェクトのための複雑な遺伝子操作動物を作成する他のコードギアスと繁殖が。繁殖を複雑なスキームを使用して、いくつかの遺伝子の削除と追加他系統を作成します。多く関連の遺伝子疾患を含むのための動物モデルが、動物の遺伝子工学によって糖尿病と網膜 pigmentos、アルツハイマー病、がん、脳卒中、他の血液疾患に限定されない、開発されました。

ほとんど繁殖のスキームは、メンデル遺伝学遺伝子比率を予測するに頼ることができます。とき 1 つ変更された遺伝子 (ヘテロ) マウスと野生型マウスを飼育すると、期待どおりの結果は、野生型動物の 50% および 50% のヘテロ接合体でしょう。(ホモ接合体) の 2 つの変更された遺伝子を持つマウスと交配なしの野生型マウスは、ヘテロ接合体をされているすべての子孫になります。すべての 3 つの遺伝子型が以下の割合で存在する必要があります 2 つのヘテロ接合体の動物を超えた場合: 野生型 25%、50% のヘテロ接合体、および 25% について。それは胚致死遺伝子を検出することができますこれらの期待から (すなわち。、ホモ接合体の子孫の生産がない場合)。

Figure 1
図 1。メンデル遺伝学に基づいて可能な交配と転帰。動物の野生型遺伝子組み換えしていません、として指定されます (+ +)。ヘテロ接合体動物変更された遺伝子のコピーを 1 つ、として指定されます (-/+);ホモ動物変更遺伝子の両方のコピーを持っている、として指定されます (-/-)。

マウスおよびラットの数百万を毎年、生物医学研究で使用するため繁殖し、多くの機関を社内リサーチのオプションを増加コストを減らすためにこれを選択します。自社繁殖の利点は、1) 研究者が遺伝学を操作することができる選択的な育成を通して動物の研究ニーズに合わせて妊娠を時間ことができます 2) と 3) 彼らは必要に応じて胚と新生児を操作できます。しかし、繁殖に成功方式をセットアップするには、1 つは齧歯動物の発情周期を理解する必要があります。さらに、別の合致スキーム、齧歯動物の繁殖行動と離乳の考察. このビデオ プレゼンテーションで説明するすべての要因についての知識をもたなければなりません。

齧歯動物の発情周期の見直しから始めましょう。ラットとマウスの両方が polyestrous、彼らは 1 つ以上発情年か繁殖期のサイクルを持っている意味です。それぞれは 4-5 日続くを入れ、4 つの段階に分けることができます: metestrus、発情、proestrus、発情。発情期は排卵期は、女性が、proestrus や発情期にある場合彼女が妊娠する準備ができていることを意味。

発情周期の段階を決定する 1 つの方法は、目視検査です。ケージの蓋で休んで前足と尻尾を手動で動物を抑制し、膣口や周囲の組織のサイズを調べ、慎重に。Proestrus フェーズでは、膣の開口部が広いとはピンク色で、非常に湿った周囲の組織の腫れが特徴です。多くの場合しわや開口部の背側と腹側のエッジに沿って縞があります。発情、周囲の腫れの膣口を削減と組織は、しっとりとピンクです。Metestrus、中に膣の開口部は最小限、ごくわずかな腫れがあります。発情中に膣の周辺組織の腫脹がない、開口部が小さいまたは閉じた。

発情周期の段階を決定するための別より正確な方法は、膣細胞診洗浄や拭き取りのいずれかによってどのセルの採取です。洗浄、滅菌 200-1 マイクロリットル ヒントの最後にラテックスの電球を配置し、ピペットへの引く約 100 マイクロリットル二重滅菌蒸留水のこと。次に、ケージからマウスを持ち上げて、あなたに向かって彼女の尾を持つワイヤー バー ケージの上に彼女を置きます。しっかりと尾を持ち、前足だけが蓋を把握するようにマウスの後半部を昇格します。オリフィスを貫通せず、腟運河の開通で塗りつぶされた先端の端を置きます。やさしく膣口の水のおよそ 25-50 マイクロリットルを追放する電球を抑制します。ヒント挿入することがなく管に液体を吸引する自発的に。ゆっくりと電球に加わる圧力を解放し、流体を先端に撤回します。4-5 回同じ先端、電球、および流体を使用して十分な単一のサンプル内のセル数を取得するを繰り返します。スライド ガラスに流体を配置し、塗抹標本を許可する部屋の温度で完全に乾燥。一度乾燥し、後で使用するためこれらの発情の塗抹標本を保存ことができます。 または彼らは、ワンステップの汚れとは要求しない固定ライト-ギムザ染色を使用してすぐに汚すことができます。スライドは、45 〜 60 秒の汚れに配置されます。

その一方で、拭き取り、ため生理食塩水で 2 mm 綿の先端アプリケータを濡れています。拘束されたマウスの膣内にアプリケーターの先端を挿入し、膣壁に対して先端をロールをそっと入れます。綿棒を慎重に削除し、スライド間で綿棒を圧延によって乾燥したガラス スライドにセルを転送します。この手順ストレスと見なされますで、適切な拘束と正しいサイズの綿棒で優しく、実行をしないと損害を与えることができます。洗浄のようなスライドは、乾燥後に汚すことができるライト-ギムザ染色。染色, 次スライドを顕微鏡下で調べることができます。

女性が proestrus にある場合、ラウンド、整形式のクラスターが上皮細胞核、細胞質より暗い汚れを核として、細胞が見られています。彼女が発情期にある場合、セルの大半が角化扁平上皮の細胞核を持たないです。彼らは外観で角、高密度クラスターです。女性は、metestrus では、細胞は、通常白血球、特に好中球いくつか角化扁平上皮細胞の存在です。発情中に細胞の存在は、通常白血球数有核細胞が発生したです。

齧歯動物の発情周期の理解があるので、考えてみようセットアップ交配する方法。最初のステップは、性器の距離を比較することによって行われているセックスの決定です。肛門と性器の間の距離は、女性、男性のそれよりも短い。研究ニーズとひずみの繁殖効率に基づいて、合致は、1 人の女性が男性 1 人に飼育や一夫多妻制 - 2 つ以上の女性は 1 人の男性を飼育されている一夫一婦制 - することができます。

タイミングの面で齧歯動物の発情周期が短いだけの 4-5 日、長い 1 つがランダムに交配を設定できます。または、"timed 交尾"、彼女は最大の感受性と不妊治療の時点では交配ケージに女性を導入を含むを設定することができます-、proestrus または発情段階の間にであります。いずれにしても、交配する必要がありますとしてセットアップされている、一日の終わりに齧歯動物は夜行性、夜に合致する傾向があります。次の朝、雌は交尾プラグ - 続く 12 〜 24 時間後交尾の精液と膣分泌液から成る白っぽい大量の検査されます。みられる交尾栓が視覚的に明白ではない場合、膣の開口部に鈍プローブの先端をそっと挿入します。みられる交尾栓の存在は、腟口の 0.5 cm 以内プローブの進歩が低下します。任意交配の場合みられる交尾栓外観はよく 3 日を取る。プラグインの存在確認、交配しても、女性が妊娠するいるとは限りません。

一度みられる交尾栓を観察すると、女性は体重増加など妊娠の兆候の監視必要があります。外れている女性が妊娠して、プラグが発見された日か日 0 E0 し次の日は妊娠、または E1、分娩までのように右の最初の日として考慮される場合-それは 19 ~ 21 日間の出産です。約 20-24 時間産後、雌性ラットおよびマウス、発情を受けるし、再び妊娠することができます。

一般的遺伝的突然変異のための短い繁殖寿命と動物のために使用される集中的な繁殖法でオスの動物女性と、パップス ケージに残されます、女性はすぐに別のゴミを考えることができます。このスキームと彼女は継続的に授乳を温めて、女性にストレスになることですができます。それどころか、非集中飼育方式を含む彼女が目に見えて妊娠女性を分離してない彼女のくずが乳離れするまでオスのケージに彼女を返す、この負担を軽く育種方式。

マウスおよびラットの繁殖特性に影響を与えることができる多くの要因があります。頻繁に出てくるいくつかの確認してみましょう。女性ブリーダーの活力は、近親交配のレベルによって大きく異なります。ザイモグラムがいる動物より丈夫で活発な大きく、強い仔を出すため。繁殖成功率に影響を与えることができますもう一つの要因は積極的な動作です。C57bl/6 マウスなどのいくつかの一般的に使用される系統の繁殖を妨げることができます侵略を表示する傾向があります。積極的なひずみを繁殖、すべてリットル必要があります密接に見ていた。積極的な子犬を含むごみから動物を繁殖のため使用しないでください。温度・湿度・照明変動の減少を引き起こすことができます効率を繁殖。騒音や飼育室内振動は、有害な影響を引き起こすことも示されています。遺伝の修正を持つ動物はより少なく丈夫、肥沃ながちで前に、または出生後すぐに子犬の致死突然変異のいくつか発生可能性があります。

今これらの実験動物の子犬を引き離す方法を簡単に確認してみましょう。離乳を始める時期は、育種方式により異なります。非集中的な繁殖の場合若者は 21 28 日齢で離乳があります。しかし、集中的な繁殖の場合各くずの子犬は古いように 20 日目子犬で生まれのごみを次の場合であることから引き離されます。齧歯動物は、8 週間ほど若い交尾を始めることができます、のでオスとメスの子犬が離乳で分かれています。可能な限り、最近引き離された子犬が単独で収納しない必要があります。

くずには、特定の性別の 1 つだけの子犬が含まれている場合、別ごみから同じ性別の子犬とこの子犬を家に試行を出す必要があります。以下の原稿で子犬の離乳の可能な住宅オプションのとおりです。離乳マウスおよびラットは盛況であることを保証するために毎日チェックする必要があります。食糧供給、少量の食品、マウス、あたり 1 つのペレットはケージ上部に追加で食糧を最初の 7-10 日のケージの床に配置する必要があります。これは、唯一の食料源として齧歯動物の食事を持っていることに移行する動物を奨励します。水の供給、動物は、自動散水システムをラックに収容されて場合でもにボトルを追加してください。これは、脱水症状を防ぐためです。

最後に、科学者が自分に有利に自社繁殖アプローチを使用してどのように見てみましょう。交配のセットアップの最も一般的なアプリケーションの 1 つ変更された遺伝子を持つマウスを開発することです。遺伝子の機能を研究するには、研究者は多くの場合その遺伝子のコードを混乱させます。ただし、人間のようにこれらの動物は二倍体であり、このように同じ遺伝子の 2 つのコピーを持っています。したがって、遺伝子を完全に破壊するために変更されたマウスは両方のコピー機能不全、つまりホモ接合体ノックアウト動物を作り出すために繁殖する必要があります。機能不全の 1 つのコピーを持つマウスはヘテロ接合体と呼ばれるまたは hets。

社内交尾のセットアップの他の利点はテスト混合物への出生前暴露の効果をテストします。たとえば、ここで研究者提供妊娠中の女性 E13 に E7 からアルコールを含む液体ダイエット。E13、上彼ら解剖妊娠中の女性、胎児の脳を取得し、薄片にスライスしています。最後に、スライドの染色では, 出生前アルコール露出に神経組織の細胞死が増加したこと。

最後に、社内の繁殖は産後うつ病のようなポスト妊娠障害の研究も可能です。この研究では、科学者は最初に授乳期間中にダムからごみを移動しました。その後、60 分後は、ダムに子犬を再導入。女性のストレスを誘発する新規男性侵入者をケージに追加。さらに、研究者は子犬グルーミング, および看護のような別の母体ケア行動のためだけでなく、攻撃、侵入者男性の噛み込みなど母体の侵略のためのダムを観察しました。得られたデータは、そのストレスが産後の母体の侵略とケアの両方に重大な影響を明らかにしました。

繁殖と離乳マウスおよびラットの実験室での基礎にゼウスのビデオを見てきただけ。齧歯動物の発情周期のより良い理解を持っているそしてまたサイクルの段階を確認する方法およびセットアップ成功交尾スキームを使用する方法を知っている必要があります。繁殖行動に影響を与える要因も確認しましたどのように説明し、子犬離乳マウスおよびラットに。いつも見てくれてありがとう!

Procedure

1. 動物をペアリングするときに必要な情報には、適切な命名、男性と女性、ブリーダーの生年月日およびセットアップ日付を利用した動物のひずみ/株式が含まれています。正確な記録は、コロニーの繁殖が不可欠です。

2 マウスとラットの性決定は、性器の距離を比較することによって行われます。女性で肛門と外陰部との間の距離が男性よりも短いです。オスの動物で陰嚢の嚢の存在は、別のセックスの指標です。

3. を選択し、合致を設定

注: 使用することができます 2 つの合致スキームがあります。

  1. Proestrus/発情交尾をタイムアウトしました: このメソッド最大の感受性と不妊治療の時点で男性と女性をペアリングに依存します。
    1. Proestrus を示して、発情、変更の外部生殖器の目視検査か膣分泌物 (下記参照) の細胞診、女性で発情周期をモニターしなければなりません。
    2. 女性が proestrus の発情期であると判断、彼女は動物の一般的に夜チームメイトとして、一日の終わりに男性とペアリングされています。
    3. 次の朝、雌がみられる交尾栓 (下記参照) を調べられます。プラグが存在しない場合女性は日中に男性とみられる交尾栓のチェックと一日の終わりに残ることができます。また、もはや proestrus または発情期であると判断、彼女は飼育ケージから削除されます。
  2. ランダム タイミング交尾: この手法は実際に齧歯動物の発情周期が非常に短い、4-5 日長い。
    1. このメソッドの交配をいつでも設定できますおよび女性すべての朝と夕方、プラグが観察されるまで交尾のプラグがチェックされます。
    2. 女性は、男性と夕方にはペアになっています。
    3. 彼女は最初とプラグが観察されるまで毎日の終わりにみられる交尾栓のチェックされます。通常、このメソッドを使用するときに見られるようにプラグの 3 つ以上の日かかります。

4. 妊娠の予測

日 10-12、周りの妊娠中に後でまで子犬の触診はむずかしいので、齧歯動物のための商業超音波システムが開発されています。ただし、いくつかの動物研究施設は、この技術を持っています。したがって、交尾プラグの可視化、膣に変更、または腟細胞診の観察は、女性がくず (下記参照) を考案するときの予測を支援するために使用されます。ただし、これらのメソッドのいずれも、妊娠を確認することができます。一度みられる交尾栓を観察すると、女性は体重増加など、妊娠の兆候の監視必要があります。

5. 発情周期の段階を決定します。

  1. 目視検査
    注: マウスおよびラットの交尾時間変更 proestrus と発情を示している膣の目視観測は発情周期の段階を決定する最も簡単な方法、特別な装置を必要としません。
    1. 視覚的な方法を使用して周期を評価するとき光源膣組織の知覚色を変更でき、評価が難しく、部屋の照明に関して同じエリアで目視検査を行うことが重要です。たとえば、紫色の LED ライトでキャストにすると視覚的検出はより難しくなります。
    2. 目視による発情周期の段階を評価するには、各マウスする必要があります手動で抑制する尾ケージ蓋の上安静時前足で。
    3. 各女性の膣口は、腟と腟口のサイズを周辺組織の条件に基づいて評価されます。2
      1. Proestrus、中に膣口が広いと周囲の組織の腫れが特徴です。組織がピンク色で、非常に湿ったです。多くの場合しわや開口部の背側と腹側のエッジに沿って縞があります。
      2. 発情中に膣口を取り巻く組織の腫脹が減少し、組織がなく、しっとりとピンク。
      3. Metestrus 中に膣の開口部は最小限、ごくわずかな腫れがあります。
      4. 発情中に膣の周辺組織の腫脹がないと膣の開口部は小さく、閉じた。
  2. 膣細胞診
    マウスとラットの両方が polyestrous、発情周期が非常に短く、4-5 日に至るです。発情のすべての 4 つの段階を識別する必要があります: proestrus、発情、metestrus、発情。膣細胞診は、これらの段階を決定するための非常に正確な方法です。サンプル コレクションの 2 つの方法がある: 非侵襲的膣洗浄法と膣を拭き取りの侵襲的な方法です。
    1. 膣洗浄
      1. 必要な材料は、滅菌 200 μ l ピペット先端、ラテックス球根滅菌二重蒸留水 (ddH20)、およびスライド ガラスをきれい。
      2. 滅菌 200 μ l チップの端にラテックスの電球を配置します。滅菌 ddH2O の約 100 μ l をピペットに描画します。
      3. ケージからマウスを持ち上げて、あなたに向かって彼女の尾を持つワイヤー バー ケージの上に彼女を置きます。
      4. しっかりと尾を持ち、マウスの後半部に昇格します。マウスだけ前足蓋を把握しなければならなくなります。
      5. マウスの排尿、排尿を停止までを待ちます。尿があるべき膣に運河の入り口に残って、その開口部を ddH2O. 変更洗浄に使用された先端の小さな噴出で洗うことができます。
      6. オリフィスを貫通せず、腟運河の開通で ddH2O で満たされた先端の端を置きます。
      7. 水の量の半分に 4 分の 1 を追放する電球を優しく押す (25 ~ 50 μ l) 腟運河の開通で。ヒント挿入することがなく管に液体を吸引する自発的に。ゆっくりと電球に加わる圧力を解放します。流体を先端に戻って撤回します。
      8. バルブに流体の吸引を防ぐために余りにすぐに圧力を解放しないでください。フィルター選択されたヒントは、この目的のため役に立つことがあります。
      9. 4-5 回同じ先端、電球、および流体を使用して十分な単一のサンプル内のセル数を取得する前の手順を繰り返します。
      10. スライド ガラスに流体を配置し、塗抹標本を許可する部屋の温度で完全に乾燥。
      11. それぞれのマウスの新しいピペットを使用します。
      12. 一度乾燥し、これらの発情の塗抹標本のすぐに染色または格納され、後日、染色することができます。ライト-ギムザ染色が一般的なスライドを染色します。細胞が染色のプロセス中に洗浄することを防ぐためにスライドの固定を必要としないワンステップ汚れ市販されているこの汚れ。スライドは、製造元の指示に従って、45-60 秒間染色に配置されます。
      13. スライドが顕微鏡の下で検査し、見える細胞サイクルの段階に対応する: 1) ラウンド、整形式のクラスター核よりも暗い汚れ核と上皮細胞と細胞が見られる女性が proestrus の場合、細胞質;角化扁平上皮の細胞核を欠いているが外観では、角度、高密度クラスターで発生する、2) 女性が発情期にある場合のセルの大半は、します。3) 女性が metestrus の場合セルは、一緒にリンクされている 2 つのソーセージのような形は、暗く汚れた核白血球 (具体的には現在いくつか角化扁平上皮細胞と好中球)4) 中に発情、細胞の存在は、通常白血細胞核上皮細胞は、いくつかの発生と、.
    2. 膣を拭き取り
      1. 必要な材料は、2 mm 径の先端、きれいなガラス顕微鏡スライド、滅菌生理食塩水と滅菌綿棒です。
      2. 生理食塩水で綿棒を濡れています。
      3. 拘束されたマウスの膣にアプリケーターの先端を挿入します。
      4. ゆっくりと曲がり、膣壁に対して先端をロールバックします。綿棒を慎重に取り外します。
      5. セルは、スライド間で綿棒を圧延によって乾燥したガラス スライドに転送されます。
      6. スライドが乾燥していたら、それを汚すことができるライト-ギムザ染色。
        緊張に満ちたプロシージャであるかみや -ときを強調したマウスは発情周期中断することができます。拭き取りによる膣や子宮頸部の刺激は、偽妊娠を引き起こすことができます。適切な拘束と正しいサイズの綿棒で優しく、実行がいない場合、膣粘膜の繰り返しの綿棒は損傷を引き起こすことができます。3, 4

Figure 2
図 2。膣細胞診 - 齧歯動物の発情期のさまざまな段階のサイクルします。

6. みられる交尾栓を可視化

このプラグは膣分泌液と精液から成り、12-24 h postcopulation の膣内が解決しません。プラグの存在は交尾を確認するが、女性が妊娠するいるとは限りません。プラグの女性が妊娠中の場合、妊娠の最初の日は、プラグが見つかった後の日と見なされます。

  1. ケージからマウスを持ち上げて、あなたに向かって彼女の尾を持つワイヤー バー ケージの上に彼女を置きます。
  2. 膣の開口部をよりよく表示できるように背中をアーチに尾のすぐ上の圧力を適用することによってマウスの位置。
  3. 白っぽい固まりの彼女の膣口を観察します。みられる交尾栓は視覚的に明白ではないかもしれないが、鈍プローブを使って確認することができます。
  4. 膣の開口部にプローブの先端を使用して、カチッします。みられる交尾栓の存在は、腟口の 0.5 cm 以内プローブの進歩が低下します。
  5. プローブをアルコールで消毒、各使用する前に完全に乾燥する必要があります。

女性は、くずは、生年月日、産仔数、生まれ、離乳、番号数の日付男性: 女性の比率が子犬、すべての遺伝子型の比率が記録されます。くず内の遺伝子型は、両親の遺伝子型に対応していない場合の再テストは真の遺伝子型を確認する行う必要があります。

7. 離乳

マウスおよびラットの妊娠は約 21 日です。若者は、21 28 日齢で引き離されます。両方のマウスおよびラットは生後 8 週には早くも繁殖できる、従って子犬は早い年齢で性別で区切ることが不可欠です。集中的な繁殖は、現在次のごみが生まれたときから古い子犬を防ぐために 20 日に各くずの子犬、離乳になる必要があります。Nonintensive 繁殖のため子犬のままになります母親過去 20 日齢、年齢の 28 日までに多くの場合。これは多くの遺伝子組み換え系統のために非常に有益することができます子犬は nonengineered として、活発ではないかもしれないまたは野生型の動物。

男性と女性の子犬が離乳で分かれています。可能な限り、最近引き離された子犬が単独で収納しない必要があります。くずには、特定の性別の 1 つだけの子犬が含まれている場合に、同じ性別の他の人とこの子犬を家に試行する必要があります。可能な住宅のオプション: 1)、集中的な繁殖ケージはともかく母と単一のメスの子犬が残ることがあります同じ時代の別の猫から他の同じ性別の子犬 2 単一の女性または男性の子犬も構いません女性を父に収容されるべき単一男性子犬を許可するようにケージから削除できる 3) 場合は親は一夫一婦のペア、・ 4) シングル男性の子犬は、5 週齢を女の兄弟とバッティングすることがあります。子犬の性別は、不適切な分離の子犬から不要なリットルを防ぐために離乳後 1 週間検証すべき。

離乳マウスおよびラットは盛況であることを保証するために毎日チェックする必要があります。最近引き離されたマウスに食品 (あたり 1 つのペレットの少量を提供ケアおよび実験動物の使用のためのガイド5の食品が糞便や尿で汚れているからそれを防ぐためにこのような方法で動物に指定しなければならない状態がマウス) は、ケージの床にガラス皿 (ペトリ皿) に配置されます。これは、唯一の食料源として齧歯動物の食事を持っていることに移行する動物を奨励します。自動散水システムをケージに水を提供するラックに収容されている動物にもマウスが脱水であると表示される場合、ケージに水のボトルを追加できます。

コロニー タイプ 説明
ICR ザイモグラム アルビノ
スイス ・ ウェブスター ザイモグラム アルビノ
Balb/c 近交系 アルビノ
FVB 近交系 アルビノ
C57BL/6 近交系 黒のコート色
C3H 近交系 茶色のコート色
DBA/2 近交系 ブラウン/グレーのコート色
無胸腺ヌード (ν/ν) 近交系 毛のないです。
SCID 近交系 重度複合免疫不全マウス様々 なコートの色

表 1。マウスの汚れや株によく使用されます。

コロニー タイプ 説明
Sprague-dawley ザイモグラム アルビノ
ウィスター ザイモグラム アルビノ
フィッシャー 344 近交系 アルビノ
ルイス ・ 近交系 アルビノ
長い・ エヴァンス 近交系 フード付き、黒と白

表 2。一般的に使用されるラット系統と株式

Summary

社内繁殖コロニーは、特に胎児や新生児を活用した事業で、研究するための柔軟性を提供しています。交尾プラグと膣細胞診交配のタイミングなどの手法、概念および妊娠の日付より正確に予測できます。これにより、研究者がより慎重に彼らの実験を計画します。ライト サイクル、温度、湿度、振動などの環境要因を制御する繁殖結果を最適化します。

References

  1. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. A Jackson Laboratory Resource Manual. http://ko.cwru.edu/info/breeding_strategies_manual.pdf.
  2. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., and Taft, R. A. 2012. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7, 1-5.
  3. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. 2012. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J. Vis. Exp. 67, e4389. doi:10.3791/4389.
  4. Mamrot, J., Pangestu, M., Walker, D., Gardner, D. K., and Dickerson, H. 2015. Confirmed dioestrus in pseudopregnant mice using vaginal exfoliative cytology improves embryo transfer implantation rate. Reproductive BioMedicine Online. 31. 538-543.
  5. Institute for the Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. Washington (DC): National Academies Press.

1. 動物をペアリングするときに必要な情報には、適切な命名、男性と女性、ブリーダーの生年月日およびセットアップ日付を利用した動物のひずみ/株式が含まれています。正確な記録は、コロニーの繁殖が不可欠です。

2 マウスとラットの性決定は、性器の距離を比較することによって行われます。女性で肛門と外陰部との間の距離が男性よりも短いです。オスの動物で陰嚢の嚢の存在は、別のセックスの指標です。

3. を選択し、合致を設定

注: 使用することができます 2 つの合致スキームがあります。

  1. Proestrus/発情交尾をタイムアウトしました: このメソッド最大の感受性と不妊治療の時点で男性と女性をペアリングに依存します。
    1. Proestrus を示して、発情、変更の外部生殖器の目視検査か膣分泌物 (下記参照) の細胞診、女性で発情周期をモニターしなければなりません。
    2. 女性が proestrus の発情期であると判断、彼女は動物の一般的に夜チームメイトとして、一日の終わりに男性とペアリングされています。
    3. 次の朝、雌がみられる交尾栓 (下記参照) を調べられます。プラグが存在しない場合女性は日中に男性とみられる交尾栓のチェックと一日の終わりに残ることができます。また、もはや proestrus または発情期であると判断、彼女は飼育ケージから削除されます。
  2. ランダム タイミング交尾: この手法は実際に齧歯動物の発情周期が非常に短い、4-5 日長い。
    1. このメソッドの交配をいつでも設定できますおよび女性すべての朝と夕方、プラグが観察されるまで交尾のプラグがチェックされます。
    2. 女性は、男性と夕方にはペアになっています。
    3. 彼女は最初とプラグが観察されるまで毎日の終わりにみられる交尾栓のチェックされます。通常、このメソッドを使用するときに見られるようにプラグの 3 つ以上の日かかります。

4. 妊娠の予測

日 10-12、周りの妊娠中に後でまで子犬の触診はむずかしいので、齧歯動物のための商業超音波システムが開発されています。ただし、いくつかの動物研究施設は、この技術を持っています。したがって、交尾プラグの可視化、膣に変更、または腟細胞診の観察は、女性がくず (下記参照) を考案するときの予測を支援するために使用されます。ただし、これらのメソッドのいずれも、妊娠を確認することができます。一度みられる交尾栓を観察すると、女性は体重増加など、妊娠の兆候の監視必要があります。

5. 発情周期の段階を決定します。

  1. 目視検査
    注: マウスおよびラットの交尾時間変更 proestrus と発情を示している膣の目視観測は発情周期の段階を決定する最も簡単な方法、特別な装置を必要としません。
    1. 視覚的な方法を使用して周期を評価するとき光源膣組織の知覚色を変更でき、評価が難しく、部屋の照明に関して同じエリアで目視検査を行うことが重要です。たとえば、紫色の LED ライトでキャストにすると視覚的検出はより難しくなります。
    2. 目視による発情周期の段階を評価するには、各マウスする必要があります手動で抑制する尾ケージ蓋の上安静時前足で。
    3. 各女性の膣口は、腟と腟口のサイズを周辺組織の条件に基づいて評価されます。2
      1. Proestrus、中に膣口が広いと周囲の組織の腫れが特徴です。組織がピンク色で、非常に湿ったです。多くの場合しわや開口部の背側と腹側のエッジに沿って縞があります。
      2. 発情中に膣口を取り巻く組織の腫脹が減少し、組織がなく、しっとりとピンク。
      3. Metestrus 中に膣の開口部は最小限、ごくわずかな腫れがあります。
      4. 発情中に膣の周辺組織の腫脹がないと膣の開口部は小さく、閉じた。
  2. 膣細胞診
    マウスとラットの両方が polyestrous、発情周期が非常に短く、4-5 日に至るです。発情のすべての 4 つの段階を識別する必要があります: proestrus、発情、metestrus、発情。膣細胞診は、これらの段階を決定するための非常に正確な方法です。サンプル コレクションの 2 つの方法がある: 非侵襲的膣洗浄法と膣を拭き取りの侵襲的な方法です。
    1. 膣洗浄
      1. 必要な材料は、滅菌 200 μ l ピペット先端、ラテックス球根滅菌二重蒸留水 (ddH20)、およびスライド ガラスをきれい。
      2. 滅菌 200 μ l チップの端にラテックスの電球を配置します。滅菌 ddH2O の約 100 μ l をピペットに描画します。
      3. ケージからマウスを持ち上げて、あなたに向かって彼女の尾を持つワイヤー バー ケージの上に彼女を置きます。
      4. しっかりと尾を持ち、マウスの後半部に昇格します。マウスだけ前足蓋を把握しなければならなくなります。
      5. マウスの排尿、排尿を停止までを待ちます。尿があるべき膣に運河の入り口に残って、その開口部を ddH2O. 変更洗浄に使用された先端の小さな噴出で洗うことができます。
      6. オリフィスを貫通せず、腟運河の開通で ddH2O で満たされた先端の端を置きます。
      7. 水の量の半分に 4 分の 1 を追放する電球を優しく押す (25 ~ 50 μ l) 腟運河の開通で。ヒント挿入することがなく管に液体を吸引する自発的に。ゆっくりと電球に加わる圧力を解放します。流体を先端に戻って撤回します。
      8. バルブに流体の吸引を防ぐために余りにすぐに圧力を解放しないでください。フィルター選択されたヒントは、この目的のため役に立つことがあります。
      9. 4-5 回同じ先端、電球、および流体を使用して十分な単一のサンプル内のセル数を取得する前の手順を繰り返します。
      10. スライド ガラスに流体を配置し、塗抹標本を許可する部屋の温度で完全に乾燥。
      11. それぞれのマウスの新しいピペットを使用します。
      12. 一度乾燥し、これらの発情の塗抹標本のすぐに染色または格納され、後日、染色することができます。ライト-ギムザ染色が一般的なスライドを染色します。細胞が染色のプロセス中に洗浄することを防ぐためにスライドの固定を必要としないワンステップ汚れ市販されているこの汚れ。スライドは、製造元の指示に従って、45-60 秒間染色に配置されます。
      13. スライドが顕微鏡の下で検査し、見える細胞サイクルの段階に対応する: 1) ラウンド、整形式のクラスター核よりも暗い汚れ核と上皮細胞と細胞が見られる女性が proestrus の場合、細胞質;角化扁平上皮の細胞核を欠いているが外観では、角度、高密度クラスターで発生する、2) 女性が発情期にある場合のセルの大半は、します。3) 女性が metestrus の場合セルは、一緒にリンクされている 2 つのソーセージのような形は、暗く汚れた核白血球 (具体的には現在いくつか角化扁平上皮細胞と好中球)4) 中に発情、細胞の存在は、通常白血細胞核上皮細胞は、いくつかの発生と、.
    2. 膣を拭き取り
      1. 必要な材料は、2 mm 径の先端、きれいなガラス顕微鏡スライド、滅菌生理食塩水と滅菌綿棒です。
      2. 生理食塩水で綿棒を濡れています。
      3. 拘束されたマウスの膣にアプリケーターの先端を挿入します。
      4. ゆっくりと曲がり、膣壁に対して先端をロールバックします。綿棒を慎重に取り外します。
      5. セルは、スライド間で綿棒を圧延によって乾燥したガラス スライドに転送されます。
      6. スライドが乾燥していたら、それを汚すことができるライト-ギムザ染色。
        緊張に満ちたプロシージャであるかみや -ときを強調したマウスは発情周期中断することができます。拭き取りによる膣や子宮頸部の刺激は、偽妊娠を引き起こすことができます。適切な拘束と正しいサイズの綿棒で優しく、実行がいない場合、膣粘膜の繰り返しの綿棒は損傷を引き起こすことができます。3, 4

Figure 2
図 2。膣細胞診 - 齧歯動物の発情期のさまざまな段階のサイクルします。

6. みられる交尾栓を可視化

このプラグは膣分泌液と精液から成り、12-24 h postcopulation の膣内が解決しません。プラグの存在は交尾を確認するが、女性が妊娠するいるとは限りません。プラグの女性が妊娠中の場合、妊娠の最初の日は、プラグが見つかった後の日と見なされます。

  1. ケージからマウスを持ち上げて、あなたに向かって彼女の尾を持つワイヤー バー ケージの上に彼女を置きます。
  2. 膣の開口部をよりよく表示できるように背中をアーチに尾のすぐ上の圧力を適用することによってマウスの位置。
  3. 白っぽい固まりの彼女の膣口を観察します。みられる交尾栓は視覚的に明白ではないかもしれないが、鈍プローブを使って確認することができます。
  4. 膣の開口部にプローブの先端を使用して、カチッします。みられる交尾栓の存在は、腟口の 0.5 cm 以内プローブの進歩が低下します。
  5. プローブをアルコールで消毒、各使用する前に完全に乾燥する必要があります。

女性は、くずは、生年月日、産仔数、生まれ、離乳、番号数の日付男性: 女性の比率が子犬、すべての遺伝子型の比率が記録されます。くず内の遺伝子型は、両親の遺伝子型に対応していない場合の再テストは真の遺伝子型を確認する行う必要があります。

7. 離乳

マウスおよびラットの妊娠は約 21 日です。若者は、21 28 日齢で引き離されます。両方のマウスおよびラットは生後 8 週には早くも繁殖できる、従って子犬は早い年齢で性別で区切ることが不可欠です。集中的な繁殖は、現在次のごみが生まれたときから古い子犬を防ぐために 20 日に各くずの子犬、離乳になる必要があります。Nonintensive 繁殖のため子犬のままになります母親過去 20 日齢、年齢の 28 日までに多くの場合。これは多くの遺伝子組み換え系統のために非常に有益することができます子犬は nonengineered として、活発ではないかもしれないまたは野生型の動物。

男性と女性の子犬が離乳で分かれています。可能な限り、最近引き離された子犬が単独で収納しない必要があります。くずには、特定の性別の 1 つだけの子犬が含まれている場合に、同じ性別の他の人とこの子犬を家に試行する必要があります。可能な住宅のオプション: 1)、集中的な繁殖ケージはともかく母と単一のメスの子犬が残ることがあります同じ時代の別の猫から他の同じ性別の子犬 2 単一の女性または男性の子犬も構いません女性を父に収容されるべき単一男性子犬を許可するようにケージから削除できる 3) 場合は親は一夫一婦のペア、・ 4) シングル男性の子犬は、5 週齢を女の兄弟とバッティングすることがあります。子犬の性別は、不適切な分離の子犬から不要なリットルを防ぐために離乳後 1 週間検証すべき。

離乳マウスおよびラットは盛況であることを保証するために毎日チェックする必要があります。最近引き離されたマウスに食品 (あたり 1 つのペレットの少量を提供ケアおよび実験動物の使用のためのガイド5の食品が糞便や尿で汚れているからそれを防ぐためにこのような方法で動物に指定しなければならない状態がマウス) は、ケージの床にガラス皿 (ペトリ皿) に配置されます。これは、唯一の食料源として齧歯動物の食事を持っていることに移行する動物を奨励します。自動散水システムをケージに水を提供するラックに収容されている動物にもマウスが脱水であると表示される場合、ケージに水のボトルを追加できます。

コロニー タイプ 説明
ICR ザイモグラム アルビノ
スイス ・ ウェブスター ザイモグラム アルビノ
Balb/c 近交系 アルビノ
FVB 近交系 アルビノ
C57BL/6 近交系 黒のコート色
C3H 近交系 茶色のコート色
DBA/2 近交系 ブラウン/グレーのコート色
無胸腺ヌード (ν/ν) 近交系 毛のないです。
SCID 近交系 重度複合免疫不全マウス様々 なコートの色

表 1。マウスの汚れや株によく使用されます。

コロニー タイプ 説明
Sprague-dawley ザイモグラム アルビノ
ウィスター ザイモグラム アルビノ
フィッシャー 344 近交系 アルビノ
ルイス ・ 近交系 アルビノ
長い・ エヴァンス 近交系 フード付き、黒と白

表 2。一般的に使用されるラット系統と株式

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