固相合成

Organic Chemistry II

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Overview

ソース: Vy 雅洞とダイアン ル、化学、カリフォルニア大学アーバイン校、カリフォルニア州部

メリフィールドの固相合成がノーベル賞を受賞した発明反応物分子が固体支持体にバインドされているし、目的の化合物を形成する一連の化学反応を経る。分子は固体のサポートにバインドされて、余分な試薬および副産物は、ターゲット化合物の樹脂にバインドされたまま、不純物を洗い流すことによって削除できます。具体的には、固相ペプチド合成 (SPP) この概念を示すための例を紹介します。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 有機化学 II. 固相合成. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

Principles

固相合成法は、分子の合成を効率化するために使用方法です。コンビナトリアル ・ ケミストリー (時間の短い期間で分子の数が多いを準備するために使用する手法) で使用される多くの場合、ライブラリの生成する化合物の精製、および全体的な化学合成の容易さのため。固相合成は通常、樹脂の使用を含む開始の建物 blockcan 簡単にバインド、pre-functionalized、非水溶性ポリマー系素材。ビルディング ブロックは、樹脂の上に追加され、deprotected しソリューション (図 1) に次の必要なビルディング ブロックで処理を簡単にすることができます一度に一般的に保護されています。目的の分子を総合すると、一度、樹脂から簡単に切断することができます。

堅牢なので、核酸、糖、オリゴ糖、最も一般的に、ペプチドを合成する固相合成を使用されています。発見し、1963 年にロバート ・ メリフィールドによって報告された、SPP ペプチド ライブラリを生成する最も広く利用された方法となっています。メリフィールドは、SPP の発明 1984年ノーベル賞を受賞しました。SPP は fmoc 保護 (基本敏感な) または Boc (機密性の高い酸) の利点を取ることができる簡単にN-アミノ酸を短時間でペプチドのライブラリを構築するためのグループを保護します。HBTU (結合剤) と-Pr2エタネルセプト (ベース) は、 Cをアクティブに-別のアミノ酸との結合アミノ酸の終点。Boc グループの保護はトリフルオロ酢酸など強い酸によって削除できる間、4-methylpiperidine、によって fmoc 保護グループの保護を削除できます。この実験では、ジペプチドの合成を介して SPP を示します。反応の進行を監視するのにカイザー テスト、質的研究法の第一級アミンの存在をテストするのに使用します。

Figure 1
図 1。固相ペプチド合成 (SPP) の背後にある概念。

Procedure

1. 樹脂の読み込み

  1. 100 mL ペプチド合成容器 2 chlorotrityl 塩化 (CTC) 樹脂 (1.1 ミリ モル/g、0.360 g、0.400 mmol) を追加します。N の下で 30 分間、膨張するようにし、20 mL DMF 追加2.
  2. 真空下でビーズをドレインし、10 mL の DMF を追加します。
  3. 500 mg fmoc 保護翼 OH を追加 (1.60 m モル) と 2.5 mL i -Pr2エタネルセプトと N2 15 分のミックス。
  4. 真空下で溶媒をドレインし、15 分間 fmoc 保護翼ああで読み込みを繰り返します。
  5. 真空下で溶媒をドレインし 10 ml DMFunder N2ビーズを洗浄し、真空 3 下でドレイン x。

2. 難病 fmoc 保護グループ

  1. DMF で 10 mL 20 %4 methylpiperidine を追加して 15 分間 N2の下でビーズをかき混ぜます。
  2. 真空下で溶媒をドレインし、難病を繰り返します。
  3. 3、真空下で N2ドレイン下 10 mL DMF でビーズを洗う x。

3. カイザー テストを実行します。

  1. カイザー テストを実行 1-2 滴の溶液 (0.5 mL 0.01 M KCN、24.5 mL ピリジン)、ソリューション B を追加 (1 g ニンヒドリン、20 mL のn-ブタノール)、およびソリューション C (20 g のフェノール、10 mL のn-ブタノール) 2 つの試験管にそれぞれ。他は反応を監視しながら、1 つのテスト チューブはコントロールになります。
  2. 反応試験管と 110 ° c. に 2 つの試験管を加熱する反応容器から樹脂のいくつかのビーズを追加します。
  3. 難病が完了すると、試験管の内容は濃い青/紫の色になります。難病が不完全または障害が発生した、ソリューションが黄色のままになります。コントロール テスト チューブと反応テスト チューブを比較します。

4. 次のビルディング ブロックの結合

  1. 真空下で溶媒をドレインします。
  2. 10 mL のNとビーズを洗う-メチル-2-ピロリドン N2真空下で溶媒を下水管の下。
  3. 次の結合を開始する追加 10 mL NMP、620 mgFmoc Phe-オハイオ州 (1.6 モル)、610 mg HBTU (1.6 モル) と 2.5 mLi -Pr2エタネルセプト、バブルの N2 30 分の下に樹脂ができ。
  4. 真空下で溶媒をドレインします。
  5. 3、真空下で N2ドレイン下 10 mL DMF でビーズを洗う x。
  6. カイザーを実行 (手順 3.1 3.3 参照) をテスト カップリングの完成を見る。ビーズや試験管でのソリューションは、黄色いはずです。

5. 樹脂をペプチドの切断

  1. 2.1 2.3 の手順を使用して残りの fmoc 保護グループを切断します。
  2. 真空下で溶媒を排出後は、ガレージと 3 h の N2バブル 40 mL 胸の谷間ソリューション (95 %tfa、2.5% H2O、2.5% のヒント) を追加します。
  3. ペプチド合成装置に新しい受信フラスコを置き、新しいフラスコに真空下で目的のペプチドを含む theTFA 溶液を排水します。

6. 沈殿物とペプチドの solation

  1. 4 円錐バイアルに TFA 溶液を分離し、ペプチドを沈殿させる各バイアルに 25 mL の冷たいエーテル (− 20 ° C) を追加します。
  2. 遠心分離機のバイアル (3,000 rpm、0-4 ° C) 20 分の円錐形の瓶から残りの TFA とエーテルの溶液を捨て、白色固体として必要なジペプチドを余裕にペプチド沈殿物に集中します。

固相合成製品は不溶性の物質に縛られていて合成する方法であります。

固相合成は生物学的オリゴマーとオリゴ糖、核酸、ペプチドなどの高分子を生成するよく使用されます。これらの分子は、モノマーと呼ばれるより小さい分子のサブユニットのチェーンで構成されます。オリゴマー又はポリマーの合成は、多くの手順単量体を正しい順序で追加する必要があります。

多段合成の問題ですが浄化し中間製品と呼ばれる、各ステップの安定した製品の分離は全体の収量を減少します。固相合成における中間製品まま合成を通じてしっかりサポートするバインドされます。これによりソリューション フェーズ試薬、溶剤、および洗い流されるため副産物を浄化し、ステップ間各中間製品を分離する必要があります。

このビデオは固相ペプチド合成する手順を紹介し、固相合成化学のいくつかのアプリケーションをご紹介します。

固相合成で分子は一連の反応で強固な支持に合成されます。例えば、オリゴマー又はポリマーになります一種類のモノマーを合成時に最終製品を形作る。成長のオリゴマーまたはポリマー試薬サポートから分かれて、までしっかりサポートしたり、切断、厳密にバインドされたままです。

各モノマーはポリマー鎖の一部であると、少なくとも 2 つの結合部位を持つ必要がありますが、1 つだけの結合部位は、モノマーが正しい原子にバインドされていることを確認する時に利用できます。これは合成の 1 つ以上のステップでは反応性官能基であるグループを保護することを、によって達成されます。結合サイトを復元すると、またはdeprotected、保護を変換する特定の試薬をもつ分子を扱うことによってグループに、反応性の官能基。

固相合成を開始するには、出発原料は、特別に設計された樹脂や、のみ利用可能なバインディング サイトで不溶性ポリマーにバインドされます。次に、バインドされた原料はチェーンで 2 番目の単量体の結合を許可する deprotected します。次に、カップリング剤、モノマー間の接合を容易にすると共に、チェーンで 2 番目のモノマーのソリューションが追加されます。

2 番目のモノマーを出発原料にバインド、一度結果の二量体の中間プロダクトは deprotected します。ターゲット オリゴマーまでこのプロセスが繰り返されます、または高分子が形成されています。製品は、それ精製、分離、および分析できるソリューションに固体のサポートから切断され。

固相合成はアミノ酸の鎖であるペプチドの合成に用いられます。アミン基、カルボキシル基のグループと置換基、または '側鎖のアミノ酸があります。アミンは当初保護されています。アミン deprotected、一度次のアミノ酸のカルボキシル基とペプチド結合を形成します。

今では固相合成の原理を理解しては、固相ペプチド合成には、最初の 2 つのアミノ酸を添加をデモンストレーションする手順を行ってみましょう。

手順を開始するには、100 mL 手動ペプチド合成容器に廃棄物の受信フラスコを接続します。その後、容器に 2 chlorotrityl 塩化樹脂 0.360 g を配置します。

Sidearm の容器に窒素ガス ライン、真空ラインを鋸歯状のホース アダプターに接続します。

樹脂にジメチルホルムアミドの 20 mL を追加し、窒素ガスの流れの下で 30 分のうねりに樹脂ビーズを許可します。その後、溶剤を排出するために真空を適用します。

容器に 10 mL の DMF、fmoc 保護保護アミノ酸 1.6 モルとN, n-diisopropylethylamine の 2.5 mL を追加します。樹脂に保護されたアミノ酸をロードする 15 分のためのソリューションを組み合わせた窒素ガス下でバブルします。

真空下で溶媒を除去し、2 番目の読み込みを実行します。溶媒を除去した後に、DMF、受信のフラスコに各洗浄排水の 10 mL の部分で 3 回ロードされた樹脂ビーズを揺り動かしなさい。

次に、読み込まれたビーズ DMF で 4 methylpiperidine の 20% 溶液 10 mL に追加します。15 分 fmoc 保護グループを削除するための混合物をバブルします。

溶媒をドレインし、脱保護手順を繰り返します。洗うし、ドレインのロードされた樹脂として前に、の 3 回。次のステップの準備ができるまでは、溶媒下でビーズを格納します。

まず読み込まれた化合物だった deprotected 完全にことを確認するための 2 つの試験管に各カイザー テスト ソリューションの 1 〜 2 滴

試験管に読み込まれたいくつかのビーズを置き、オイルバスで 110 度に両方のチューブを熱します。脱保護は樹脂の混合物に暗い場合完全な混合物のアミン グループの存在を示す紫に青。

カップリング ステップを開始、N2 ガスの流れの下で NMP の 10 mL でビーズを洗って最初。

その後、ロードされた樹脂に NMP の 10 mL、次 fmoc 保護保護アミノ酸 1.6 モル、カップリング剤 HBTU, の 1.6 モル、DIPEA 2.5 mL を追加します。

30 分間、樹脂の混合物を通して N2 ガスをバブルし、溶剤を排出します。洗うし、ドレインの DMF の 10 mL の部分にビーズとして前に、の 3 回。

カイザー テストを繰り返します。ビーズやソリューションに黄色、アミン グループが存在しないことを示す場合は、結合が正常に発生しました。

次に、DMF で 20 %4 methylpiperidine を持つ新しい fmoc 保護グループを切断し、DMF の 10 mL の部分にビーズを洗浄します。ターゲット ペプチドで各残りのアミノ酸の結合と脱保護を繰り返します。

アミノ酸は deprotected されて最後の後、樹脂ビーズ洗浄されている樹脂からペプチド製品を分離するペプチド胸の谷間溶液 40 mL を追加します。

3 h の樹脂の混合物で窒素ガスをバブルし、受信側のフラスコを置き換えます。真空下で新しい受信フラスコに樹脂の混合物からソリューションを転送します。

最終的な製品を生成するため、ロータリーエバポレーターと溶媒を削除します。

固相合成は、生物学と化学で広く使用されます。いくつかの例を見てみましょう。

固相合成オリゴ糖、単糖モノマー エネルギー貯蔵など、重要な生物学的役割の短い鎖であると多くの新しい合成経路を開いた。ペプチド結合とは異なりそれぞれの絆糖にはには、キラル中心が含まれています。オリゴを合成するだけでなく必要があります単量体が正しい順序で、債券も正しいの立体化学を持つ必要があります。高立体選択的プロセスによって、今日は十分に自動化されるに洗練されたそれぞれのモノマーをカップルに固相合成技術を開発しました。

固相合成は、合成の単一の合成プロセスの化合物の多くの亜種の練習であるコンビナトリアル ・ ケミストリー、一般的なアプローチです。ロードされた樹脂は、異なるモノマーまたは分子と反応する部分に簡単に分割できます。各反応後部分を洗浄して再結合します。これは、製品の目的の数が生成されるまで繰り返されます。この手法は、新しい化合物を生成するまたは分子の広い配列を持つ化合物の反応性を評価する使用できるように医薬品研究に特に便利です。

ゼウスの固相合成入門を見てきただけ。今固相合成、固相ペプチド合成のためのプロシージャおよび方法固相合成有機化学で使用例をいくつかの基本原則を理解する必要があります。見てくれてありがとう!

Results

固相ペプチド synthesisfor の手順 3 の代表的な結果。

手順 ソリューションの色
3.1 制御 - クリア、淡黄色
反応-オフ、淡黄色
3.2 制御 - クリア、淡黄色
反応-ダークブルー
3.3 暗い青ソリューション、ビーズ青-完全な脱保護または結合に失敗しました
無色、ビーズ黄色-脱保護に失敗しましたまたは完全な完了
無色の溶液ビーズ赤-不完全な結合または不完全な脱保護

テーブル 1。代表の結果 Procedure 3.

Applications and Summary

この実験では、ジペプチドの合成を介して SPP を介して固相合成の例を示しています。

化合物高速スクリーニングのためのライブラリを構築するため、固相合成はコンビナトリアルケミストリーで使用されています。それは、ペプチド、オリゴ糖、核酸を合成する一般的に使用されています。さらに、この概念は、化学合成で実装されています。異種だ、これらの固体サポート試薬しばしばリサイクルし、それに続く反作用で再利用できます。

1. 樹脂の読み込み

  1. 100 mL ペプチド合成容器 2 chlorotrityl 塩化 (CTC) 樹脂 (1.1 ミリ モル/g、0.360 g、0.400 mmol) を追加します。N の下で 30 分間、膨張するようにし、20 mL DMF 追加2.
  2. 真空下でビーズをドレインし、10 mL の DMF を追加します。
  3. 500 mg fmoc 保護翼 OH を追加 (1.60 m モル) と 2.5 mL i -Pr2エタネルセプトと N2 15 分のミックス。
  4. 真空下で溶媒をドレインし、15 分間 fmoc 保護翼ああで読み込みを繰り返します。
  5. 真空下で溶媒をドレインし 10 ml DMFunder N2ビーズを洗浄し、真空 3 下でドレイン x。

2. 難病 fmoc 保護グループ

  1. DMF で 10 mL 20 %4 methylpiperidine を追加して 15 分間 N2の下でビーズをかき混ぜます。
  2. 真空下で溶媒をドレインし、難病を繰り返します。
  3. 3、真空下で N2ドレイン下 10 mL DMF でビーズを洗う x。

3. カイザー テストを実行します。

  1. カイザー テストを実行 1-2 滴の溶液 (0.5 mL 0.01 M KCN、24.5 mL ピリジン)、ソリューション B を追加 (1 g ニンヒドリン、20 mL のn-ブタノール)、およびソリューション C (20 g のフェノール、10 mL のn-ブタノール) 2 つの試験管にそれぞれ。他は反応を監視しながら、1 つのテスト チューブはコントロールになります。
  2. 反応試験管と 110 ° c. に 2 つの試験管を加熱する反応容器から樹脂のいくつかのビーズを追加します。
  3. 難病が完了すると、試験管の内容は濃い青/紫の色になります。難病が不完全または障害が発生した、ソリューションが黄色のままになります。コントロール テスト チューブと反応テスト チューブを比較します。

4. 次のビルディング ブロックの結合

  1. 真空下で溶媒をドレインします。
  2. 10 mL のNとビーズを洗う-メチル-2-ピロリドン N2真空下で溶媒を下水管の下。
  3. 次の結合を開始する追加 10 mL NMP、620 mgFmoc Phe-オハイオ州 (1.6 モル)、610 mg HBTU (1.6 モル) と 2.5 mLi -Pr2エタネルセプト、バブルの N2 30 分の下に樹脂ができ。
  4. 真空下で溶媒をドレインします。
  5. 3、真空下で N2ドレイン下 10 mL DMF でビーズを洗う x。
  6. カイザーを実行 (手順 3.1 3.3 参照) をテスト カップリングの完成を見る。ビーズや試験管でのソリューションは、黄色いはずです。

5. 樹脂をペプチドの切断

  1. 2.1 2.3 の手順を使用して残りの fmoc 保護グループを切断します。
  2. 真空下で溶媒を排出後は、ガレージと 3 h の N2バブル 40 mL 胸の谷間ソリューション (95 %tfa、2.5% H2O、2.5% のヒント) を追加します。
  3. ペプチド合成装置に新しい受信フラスコを置き、新しいフラスコに真空下で目的のペプチドを含む theTFA 溶液を排水します。

6. 沈殿物とペプチドの solation

  1. 4 円錐バイアルに TFA 溶液を分離し、ペプチドを沈殿させる各バイアルに 25 mL の冷たいエーテル (− 20 ° C) を追加します。
  2. 遠心分離機のバイアル (3,000 rpm、0-4 ° C) 20 分の円錐形の瓶から残りの TFA とエーテルの溶液を捨て、白色固体として必要なジペプチドを余裕にペプチド沈殿物に集中します。

固相合成製品は不溶性の物質に縛られていて合成する方法であります。

固相合成は生物学的オリゴマーとオリゴ糖、核酸、ペプチドなどの高分子を生成するよく使用されます。これらの分子は、モノマーと呼ばれるより小さい分子のサブユニットのチェーンで構成されます。オリゴマー又はポリマーの合成は、多くの手順単量体を正しい順序で追加する必要があります。

多段合成の問題ですが浄化し中間製品と呼ばれる、各ステップの安定した製品の分離は全体の収量を減少します。固相合成における中間製品まま合成を通じてしっかりサポートするバインドされます。これによりソリューション フェーズ試薬、溶剤、および洗い流されるため副産物を浄化し、ステップ間各中間製品を分離する必要があります。

このビデオは固相ペプチド合成する手順を紹介し、固相合成化学のいくつかのアプリケーションをご紹介します。

固相合成で分子は一連の反応で強固な支持に合成されます。例えば、オリゴマー又はポリマーになります一種類のモノマーを合成時に最終製品を形作る。成長のオリゴマーまたはポリマー試薬サポートから分かれて、までしっかりサポートしたり、切断、厳密にバインドされたままです。

各モノマーはポリマー鎖の一部であると、少なくとも 2 つの結合部位を持つ必要がありますが、1 つだけの結合部位は、モノマーが正しい原子にバインドされていることを確認する時に利用できます。これは合成の 1 つ以上のステップでは反応性官能基であるグループを保護することを、によって達成されます。結合サイトを復元すると、またはdeprotected、保護を変換する特定の試薬をもつ分子を扱うことによってグループに、反応性の官能基。

固相合成を開始するには、出発原料は、特別に設計された樹脂や、のみ利用可能なバインディング サイトで不溶性ポリマーにバインドされます。次に、バインドされた原料はチェーンで 2 番目の単量体の結合を許可する deprotected します。次に、カップリング剤、モノマー間の接合を容易にすると共に、チェーンで 2 番目のモノマーのソリューションが追加されます。

2 番目のモノマーを出発原料にバインド、一度結果の二量体の中間プロダクトは deprotected します。ターゲット オリゴマーまでこのプロセスが繰り返されます、または高分子が形成されています。製品は、それ精製、分離、および分析できるソリューションに固体のサポートから切断され。

固相合成はアミノ酸の鎖であるペプチドの合成に用いられます。アミン基、カルボキシル基のグループと置換基、または '側鎖のアミノ酸があります。アミンは当初保護されています。アミン deprotected、一度次のアミノ酸のカルボキシル基とペプチド結合を形成します。

今では固相合成の原理を理解しては、固相ペプチド合成には、最初の 2 つのアミノ酸を添加をデモンストレーションする手順を行ってみましょう。

手順を開始するには、100 mL 手動ペプチド合成容器に廃棄物の受信フラスコを接続します。その後、容器に 2 chlorotrityl 塩化樹脂 0.360 g を配置します。

Sidearm の容器に窒素ガス ライン、真空ラインを鋸歯状のホース アダプターに接続します。

樹脂にジメチルホルムアミドの 20 mL を追加し、窒素ガスの流れの下で 30 分のうねりに樹脂ビーズを許可します。その後、溶剤を排出するために真空を適用します。

容器に 10 mL の DMF、fmoc 保護保護アミノ酸 1.6 モルとN, n-diisopropylethylamine の 2.5 mL を追加します。樹脂に保護されたアミノ酸をロードする 15 分のためのソリューションを組み合わせた窒素ガス下でバブルします。

真空下で溶媒を除去し、2 番目の読み込みを実行します。溶媒を除去した後に、DMF、受信のフラスコに各洗浄排水の 10 mL の部分で 3 回ロードされた樹脂ビーズを揺り動かしなさい。

次に、読み込まれたビーズ DMF で 4 methylpiperidine の 20% 溶液 10 mL に追加します。15 分 fmoc 保護グループを削除するための混合物をバブルします。

溶媒をドレインし、脱保護手順を繰り返します。洗うし、ドレインのロードされた樹脂として前に、の 3 回。次のステップの準備ができるまでは、溶媒下でビーズを格納します。

まず読み込まれた化合物だった deprotected 完全にことを確認するための 2 つの試験管に各カイザー テスト ソリューションの 1 〜 2 滴

試験管に読み込まれたいくつかのビーズを置き、オイルバスで 110 度に両方のチューブを熱します。脱保護は樹脂の混合物に暗い場合完全な混合物のアミン グループの存在を示す紫に青。

カップリング ステップを開始、N2 ガスの流れの下で NMP の 10 mL でビーズを洗って最初。

その後、ロードされた樹脂に NMP の 10 mL、次 fmoc 保護保護アミノ酸 1.6 モル、カップリング剤 HBTU, の 1.6 モル、DIPEA 2.5 mL を追加します。

30 分間、樹脂の混合物を通して N2 ガスをバブルし、溶剤を排出します。洗うし、ドレインの DMF の 10 mL の部分にビーズとして前に、の 3 回。

カイザー テストを繰り返します。ビーズやソリューションに黄色、アミン グループが存在しないことを示す場合は、結合が正常に発生しました。

次に、DMF で 20 %4 methylpiperidine を持つ新しい fmoc 保護グループを切断し、DMF の 10 mL の部分にビーズを洗浄します。ターゲット ペプチドで各残りのアミノ酸の結合と脱保護を繰り返します。

アミノ酸は deprotected されて最後の後、樹脂ビーズ洗浄されている樹脂からペプチド製品を分離するペプチド胸の谷間溶液 40 mL を追加します。

3 h の樹脂の混合物で窒素ガスをバブルし、受信側のフラスコを置き換えます。真空下で新しい受信フラスコに樹脂の混合物からソリューションを転送します。

最終的な製品を生成するため、ロータリーエバポレーターと溶媒を削除します。

固相合成は、生物学と化学で広く使用されます。いくつかの例を見てみましょう。

固相合成オリゴ糖、単糖モノマー エネルギー貯蔵など、重要な生物学的役割の短い鎖であると多くの新しい合成経路を開いた。ペプチド結合とは異なりそれぞれの絆糖にはには、キラル中心が含まれています。オリゴを合成するだけでなく必要があります単量体が正しい順序で、債券も正しいの立体化学を持つ必要があります。高立体選択的プロセスによって、今日は十分に自動化されるに洗練されたそれぞれのモノマーをカップルに固相合成技術を開発しました。

固相合成は、合成の単一の合成プロセスの化合物の多くの亜種の練習であるコンビナトリアル ・ ケミストリー、一般的なアプローチです。ロードされた樹脂は、異なるモノマーまたは分子と反応する部分に簡単に分割できます。各反応後部分を洗浄して再結合します。これは、製品の目的の数が生成されるまで繰り返されます。この手法は、新しい化合物を生成するまたは分子の広い配列を持つ化合物の反応性を評価する使用できるように医薬品研究に特に便利です。

ゼウスの固相合成入門を見てきただけ。今固相合成、固相ペプチド合成のためのプロシージャおよび方法固相合成有機化学で使用例をいくつかの基本原則を理解する必要があります。見てくれてありがとう!

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