ELISPOT-Test: Nachweis von IFN--Splenozyten

Immunology

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Concepts

Quelle: Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201

ELISPOT ist ein standardisierter, reproduzierbarer Assay, der verwendet wird, um zelluläre Immunantworten zu erkennen. Der Test nutzt eine enzymgebundene Immunosorbent Assay (ELISA)-basierte Methode, um einzellige Immunreaktionen zu erkennen, die durch Flecken visualisiert werden können, daher der Name ELISPOT. ELISPOT wurde erstmals 1983 von Czerkinsky als Methode zur Aufzählung der Anzahl von B-Zell-Hybridomen beschrieben, die antigenspezifische Immunglobuline produzieren (1). Dieselbe Gruppe entwickelte den Assay weiter, um die Häufigkeit von Zytokin produzierenden T-Lymphozyten zu messen. Jetzt ist ELISPOT zu einem Goldstandard für die Messung der antigenspezifischen T-Zell-Immunität in klinischen Studien und Impfstoffkandidaten geworden. Zum Beispiel sezernieren Plasmazellen und Speicher-B-Zellen nach der Impfung oder während einer Infektion Antikörper, die Schutz bieten. Typischerweise werden diese B-Zell-Antworten durch Messung von Serumtitern antigenspezifischer Antikörper bewertet. Diese Art der Analyse, die in der Regel mit ELISA gemessen wird, kann jedoch keine Speicher-B-Zellen enthalten, die auch ohne nachweisbare Serumantikörpervorhanden sein können. Darüber hinaus ist es erwiesen, dass zirkulierende Gedächtnis-B-Zellen für die schnelle und schützende Antikörperreaktion wichtig sind, die nach der erneuten Exposition von Erregern beobachtet wird, daher ist es wichtig, diese Zellen erkennen zu können. Daher sollten zur eindeutigen Beurteilung antigenspezifischer Speicher-B-Zell-Antworten sowohl ELISA als auch ELISPOT verwendet werden (2).

ELISPOT Assay verwendet eine Platte mit membrangefütterten Brunnen, die mit Antikörpern beschichtet sind, um sezernierte Proteine von Interesse zu erfassen. Dann wird die Platte mit Zellen und Reizen beladen, um die Proteinproduktion zu induzieren. Die sezernierten Proteine werden von den an der Oberfläche beschichteten Antikörpern erfasst. Nach entsprechender Inkubationszeit werden Zellen entfernt und das sezernierte Molekül wird mit einem biotinylierten Antikörper nachgewiesen, der im Vergleich zum Capture-Antikörper spezifisch für ein anderes Epitop ist. Als nächstes wird Streptavidinperoxidase hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe eines Substrats, das die Detektion der Flecken ermöglicht (Abbildung 1). Die Stärke dieses Assays ist, dass es einem erlaubt, die Anzahl der Zellen zu quantitieren, die das Protein von Interesse produzieren. Wichtig ist, dass man beurteilen kann, ob sich die Gesamtzahl der Zellen, die ein bestimmtes Protein produzieren, verändert oder ob einzelne Zellen innerhalb einer Population mehr Protein produzieren. Darüber hinaus kann es Informationen über Kinetik liefern und kann verwendet werden, um die allgemeine Immunaktivierung (Mitogen-Stimulation) relativ zu antigenspezifischen Reaktionen (Antigensimulation) zu bewerten. Der ELISPOT-Test ermöglicht den Nachweis einer aktivierten Zelle unter 300.000 Zellen nach mitogener oder antigenspezifischer Aktivierung.

Figure 1
Abbildung 1: ELISPOT-Protokollübersicht.

Die Hauptvorteile dieses Assays sind seine- a. Einfachheit- das Protokoll ist relativ einfach und unkompliziert. Es erfordert keine technische Expertise, b. Sensitivität- es ermöglicht den Nachweis von Immunzellen auf einzelzellebener Ebene und erfordert sehr wenige Zellen im Vergleich zu anderen Methoden wie Durchflusszytometrie, c. Funktionalität - es liefert quantitative Daten über Immunzellen funktion.

Diese Übungseinheit zeigt das ELISPOT-Protokoll zum Nachweis von IFN-Sezersplenozyten, aber wie oben erwähnt, kann dieser Test auch zur Beurteilung der Antikörpersekretion durch B-Zellen verwendet werden (3).

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JoVE Science Education Database. Immunologie. ELISPOT-Test: Nachweis von IFN--Splenozyten. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. Einrichtung

Puffer und Reagenzien

  1. Sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) ohne Calcium oder Magnesium
  2. Beschichtungspuffer - entweder steriles PBS oder Karbonatpuffer
  3. Assay Verdünner - 10% fetales Rinderserum (FBS) in PBS
  4. Zellkultur mittel- RPMI 1640 mit 10% FBS, Penicillin/Streptomycin, & L-Glutamin
  5. Waschpuffer- PBS mit 0,05% Tween20
  6. Doppelt destilliertes Wasser (ddH2O)
  7. Nachweis substrat- 100 mg AEC (3-Amino-9-ethyl-carbazol) in 10 ml DMF (N,N, Dimethylformamid).

ausrüstung

  1. Laminare Durchflusshaube
  2. Befeuchtter Inkubator (eingestellt auf 37°C, 5% CO2)
  3. Automatisiertes ELISPOT-Lesegerät oder Sezieren von Mikroskop

Materialien

  1. ELISPOT-Platten
  2. Sterile und nichtsterile Reservoirs
  3. Pipettierer und Spitzen
  4. Sterile serologische Pipetten
  5. Sterile, konische Polypropylenrohre
  6. Zwei Squeeze-Flaschen zum Plattenwaschen

Assay Spezifische Reagenzien

  1. Zellen - Primärzellen oder Zelllinien (hier wurden Splenozyten von C57BL/6-Mäusen verwendet)
  2. Stimulanzien- Mitogen oder Antigen (hier wurden phorbol 12-Myristate 13-Acetat (PMA, 50 ng/ml) und Ionomycin (1 m) verwendet)
  3. Primärer Antikörper- biotinylatierter Antizytokin-Detektionsantikörper (verdünnt auf 2 g/ml in Assay-Verdünnungsmittel)
  4. Sekundäre Antikörper- Streptavidin-Meerrettichperoxidase (SAv-HRP)

2. Verfahren

überzug

  1. Um die Bedingungen steril und in einer laminaren Durchflusshaube zu halten, verdünnen Sie den gereinigten Antizytokin-Capture-Antikörper auf eine Endkonzentration von 0,5-4,0 g/ml im sterilen Beschichtungspuffer. (Hinweis: für IFN- - und IL-6 verwenden Sie 5 g/ml).
  2. Übertragen Sie die Capture-Antikörperlösung, 100 l/well, auf die ELISPOT-Platte.
  3. Bedecken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung und versiegeln Sie sie, um Verdunstung zu verhindern.
  4. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4°C.

Blockieren

  1. Am nächsten Tag entdecken Sie die ELISPOT-Platte in der laminaren Strömungshaube. Um die Platte schnell auf sterile Tücher umzukehren, um die Capture-Antikörperlösung aus jedem Brunnen zu entfernen.
  2. Fügen Sie dann jedem Brunnen 200 L Zellkulturmedium hinzu. Dieser Schritt blockiert die unspezifische Bindung während des Testes.
  3. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie die Platte für 2 Stunden bei 37°C.

Beschichtungs- und Aktivierungszellen

  1. Während der Inkubation der Platte, bereiten Sie eine 2X Mitogen-Lösung mit 50 ng/ml PMA und 1 M Ionomycin in Zellkultur Medium.
  2. Bereiten Sie dann Zielzellsuspensionen auf eine Lagerkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml vor.
  3. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Zellkulturmedium aus jedem Brunnen, indem Sie die Platte schnell auf sterile Tücher in der laminaren Strömungshaube umkehren.
  4. Als Nächstes generieren Sie eine 2x serielle Verdünnung der Stammzellsuspensionslösung. Dazu fügen Sie zunächst 200 l der vorbereiteten zellulären Suspensionsstocklösung in die Brunnen in der oberen Reihe der ELISPOT-Platte ein.
  5. Fügen Sie dann 100 L des mediums einfache Zellkultur zu den nächsten fünf Reihen der Platte unter den Reihen hinzu, die eine zelluläre Stammlösung enthalten.
  6. Führen Sie danach eine 2-fache serielle Verdünnung durch, indem Sie 100 l der Zellsuspension aus der oberen Reihe in die Reihe direkt darunter pipetieren. Sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Durchmischung, indem Sie diese Lösung vorsichtig nach oben und unten pipetieren, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
  7. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden vier Zeilen.
  8. Lassen Sie die sechste Reihe nur mit dem Kulturmedium. Es wird als experimentelle Kontrolle dienen.
  9. Als nächstes fügen Sie 100 l der vorbereiteten Mitogenlösung in die Versuchsbrunnen der ersten fünf Reihen der Platte ein. In den Kontrollbrunnen und der sechsten Reihe fügen Sie 100 L der Zellkulturmedien ohne Mitogen hinzu.
  10. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Platte bei 37°C, 5%CO2 in einem Inkubator für 20-48 Stunden. (Hinweis: 20-24 Stunden sind in der Regel ausreichend, um IL-2 und TNF- zu erkennen, während 48 Stunden optimal für IL-4 und IFN-A sind).

entdeckung

Primärer Antikörper

  1. Bereiten Sie den biotinylierten Antizytokin-Detektionsantikörper auf eine Konzentration von 2 g/ml in Assay-Verdünnungsmittel vor.
  2. Bereiten Sie 20-25 ml Waschpuffer zu diesem Zeitpunkt durch Mischen von 0,05% Tween-20 in PBS.
  3. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entkappen Sie die Platte und kehren Sie sie schnell über eine Spüle um, um alle Flüssigkeit aus den Brunnen zu entfernen. (Hinweis: Nach diesem Punkt muss die Platte nicht mehr steril gehalten werden).
  4. Dann waschen Sie die Platte, indem Sie jedem Brunnen einen Waschpuffer von 200 L hinzufügen. Vertreiben Sie diese Flüssigkeit, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle flicken. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt fünf Wähbe.
  5. Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 100 l der verdünnten biotinylierten Antizytokin-Erkennungslösung hinzu. Bei Raumtemperatur 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.

Sekundärer Antikörper

  1. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, vertreiben Sie den Detektionsantikörper, indem Sie die Platte umkehren und über das Waschbecken flicken.
  2. Waschen Sie die Platte wie bisher 5 Mal mit einem Waschpuffer von 200 l, wodurch die Flüssigkeit zwischen den einzelnen Waschanlagen ausgegart ist.
  3. Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 100 l verdünnte Streu-Meerrettich-Peroxidase-Lösung hinzu (verdünnt auf ihre vorbestimmte optimale Konzentration im Assay-Verdünnungsmittel).
  4. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 1,5-2 Stunden bei 37°C.

Substrat

  1. Nach der Inkubation, nicht mehr als 15 Minuten vor Gebrauch, aktivieren Sie zuerst AEC Substratlösung nach Herstelleranweisungen.
  2. Als nächstes entsorgen Sie den Inhalt der Brunnen und waschen Sie die Platte fünfmal mit Waschpuffer, wie zuvor.
  3. Dann fügen Sie sofort 100 l vorbereitete AEC-Substratlösung in jeden Brunnen ein.
  4. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10-20 Minuten, während Sie die Punktentwicklung überwachen.
  5. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Platte mit Wasser abspülen und die Platte über das Waschbecken streichen.
  6. Bloten Sie die Platte auf Papiertücher und lassen Sie die Platte über Nacht trocknen oder bis sie vollständig trocken ist. Das Entfernen der Kunststoffschale unter der Platte erleichtert das Trocknen.

3. Datenerfassung und -analyse

  1. Nach dem Trocknen können die Spots mit einem automatisierten Plattenleser gezählt werden. Hier wird der CTL Immunospot Reader verwendet, aber dieses Protokoll kann für jeden Leser angepasst werden.
  2. Schalten Sie zuerst das Gerät ein, dann den Computer. Öffnen Sie dann das CTL-Programm und klicken Sie auf "Scananzahl".
  3. Drücken Sie "Auswurf" für das Fach, um sich von der Maschine zu erstrecken. Entfernen Sie dann den Kunststoffadapter und richten Sie die Reihe "A" auf der ELISPOT-Platte und dem Adapter aus.
  4. Wählen Sie einen Dateinamen und Speicherort für die zu speichernde Datei aus, und laden Sie die Platte auf das Fach.
  5. Klicken Sie dann auf "Laden" auf die Software und schließen Sie die Tür auf der Seite der Maschine.
  6. Drücken Sie "Start- nach dem Zählen". Stellen Sie sicher, dass die Datei gespeichert ist, und öffnen Sie dann die Software "QC" der Qualitätskontrolle, um die Daten zu analysieren und die Anzahl der Spots zu zählen.

Notizen:

  1. Die Mindestanzahl der Zellen sollte in Vorversuchen bestimmt werden. Die optimale Anzahl von Spots ist 50 €/gut. Wenn zu viele Zellen geladen werden, ist es schwierig, einzelne Stellen zu erkennen. Darüber hinaus überlappen sich die Zellen und bilden möglicherweise keine Monoschicht auf der Membran, so dass der Nachweisgrad reduziert werden kann.
  2. Berücksichtigen Sie bei der Optimierung des Experiments den erwarteten Expressionsgrad des Zielproteins. Je niedriger der Ausdruck, desto höher ist die Anzahl der Zellen, die pro Bohrkörper benötigt werden.
  3. Im Gegensatz zu ELISA ist es besser, die Platte von Hand zu waschen, als eine Plattenwäscherin zu verwenden. ELISPOT Platten sind empfindlicher und man sollte vermeiden, die PVDF-Membran zu punktieren.
  4. Man sollte die Bewegung der Platte während der Inkubationszeit begrenzen, da es dazu führen kann, dass die Flecken verschmieren.
  5. Platten sollten im Dunkeln gelagert werden, da die Exposition gegenüber direktem Licht dazu führt, dass Flecken verblassen.

Der enzymgebundene Immunospot, oder ELISPOT, Assay ist eine Methode, um die Immunantwort auf einen Erreger oder Zellschäden zu analysieren. Es ermöglicht die Quantifizierung der Aktivierung verschiedener Immunzellen durch den Nachweis bestimmter Proteine, die sie absondern. Beispielsweise wird ELISPOT häufig zur Messung von T-Zell-Antworten bei Exposition gegenüber einem fremden Antigen verwendet, indem sezernierte Zytokine erkannt werden.

Für einen auf Zytokin basierenden ELISPOT-Test beginnt der Prozess mit der Beschichtung einer ELISPOT-Mikroplatte mit einem Capture-Antikörper, der spezifisch für das Zielzytokin ist. Nach der Antikörperbeschichtung werden den Brunnen T-Zellen zugesetzt und durch einen externen Wirkstoff, wie z.B. Anti-CD3-Antikörper, stimuliert. Die Zellen sezernieren dann das Zielzytokin, das sofort durch den Capture-Antikörper immobilisiert wird. Da das Protein sofort nach der Sekretion aus lebenden Zellen ohne Verdünnung oder Abbau gefangen wird, hat dieser Test eine hohe Genauigkeit. Nachdem das Zielzytokin immobilisiert wurde, wird ein Detektionsantikörper hinzugefügt, der auch an das gefangene Zytokin bindet.

Die ELISPOT-Technik kann auch verwendet werden, um Gedächtnis-B-Zellen nach einer Infektion oder Impfung zu quantifizieren, indem ihre Produktion von spezifischen Antikörpern analysiert wird. In einem Antikörper-basierten ELISPOT wird ein spezifisches Antigen anstelle eines Antikörpers entweder für den Erfassungsschritt verwendet, bei dem das Antigen an die Platte gebunden wird, oder beim Detektionsschritt, bei dem das Antigen den Zielantikörper nach der Erfassung erkennt. In allen Variationen des Prozesses, bei T-Zellen oder B-Zellen, ist der Nachweisantikörper oder Antigen biotinyliert, was es ermöglicht, an ein Streptavidin-konjugiertes Detektionsenzym wie Meerrettichperoxidase zu binden. Dann wird nach Zugabe des Substrats der Peroxidase, AEC, ein dunkler, unlöslicher Niederschlag erzeugt. Dieser Niederschlag markiert die Position des gefangenen Proteins, und jede sekretorische Zelle ergibt einen sichtbaren Punkt, der mit einem ELISPOT-Reader oder einem Mikroskop quantifiziert werden kann. Die Größe der Flecken ist eine relative Schätzung der Menge an Protein, die von jeder Zelle abgesondert wird. Dieser Test kann Immunantworten von einzelnen Zellen erkennen, selbst in relativ kleinen Subpopulationen von sekretonischen Zellen, was es nützlich für die Untersuchung von Immunantworten auf zellulärer Ebene macht.

In diesem Video erfahren Sie, wie Sie einen ELISPOT-Test durchführen und dann die Flecken quantifizieren, die die Sekretorien darstellen.

Während des gesamten Experiments, sorgen Sie für sterile Bedingungen, indem Sie in einer laminaren Strömungshaube arbeiten und Handschuhe tragen.

Alle Berechnungen in diesem Protokoll basieren auf dem Volumen, das für eine 96-Well-Platte benötigt wird.

Verdünnen Sie zunächst den Antizytokin-Capture-Antikörper. Um dies zu tun, übertragen Sie 10 Milliliter Puffer in eine sterile 15 Milliliter konische Röhre. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 10 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter monoklonalen Antikörper in den Puffer zu geben, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erstellen. Als nächstes gießen Sie die Capture-Antikörperlösung in ein steriles Reservoir und verteilen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter in jeden Brunnen einer 96-Well-ELISPOT-Platte.

Bedecken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung, versiegeln Sie sie, um Verdunstung zu verhindern, und bebrüten Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag entdecken Sie die ELISPOT-Platte in der laminaren Strömungshaube. Um die Platte schnell auf sterile Tücher umzukehren, um die Capture-Antikörperlösung aus jedem Brunnen zu entfernen. Als Nächstes verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jedem Brunnen 200 Mikroliter Zellkulturmedium hinzuzufügen. Dieser Schritt blockiert die unspezifische Bindung während des Testes. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie in einem 37 Grad Celsius Inkubator für zwei Stunden.

Während die Platte inkubiert, bereiten Sie eine 2X Mitogenlösung vor, indem Sie einen Mikroliter PMA und 20 Mikroliter Ionomycin zu 10 Milliliter Zellkulturmedium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 15 Nanogramm pro Milliliter PMA und ein Mikromolarionomycin zu erreichen.

Zelluläre Suspensionen von Maus-Splenozyten sollten zu diesem Zeitpunkt auch in einer sterilen Haube zubereitet werden. Mit Einem Mikroskop und Hämozytometer messen Sie die Konzentration der Zellen und passen Sie das Gesamtvolumen an, bis eine Bestandskonzentration von zwei Millionen Zellen pro Milliliter erreicht ist.

Nach der Inkubation ist die Platte schnell auf sterile Tücher umgedreht, um das Zellkulturmedium aus jedem Brunnen zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter der vorbereiteten zellulären Suspensionsstocklösung in die Brunnen in der oberen Reihe der ELISPOT-Platte ein. Richten Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung ein, sodass jeder getestete Zelltyp in einen Satz von drei gruppierten Spalten eingeteilt wird. Darunter fügen Sie 100 Mikroliter einfache Zellkultur Medium zu den nächsten fünf Reihen der Platte, unter den Reihen mit zellulären Stock Lösung.

Als nächstes führen Sie eine serielle Verdünnung durch, indem Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension aus der oberen Reihe in die Reihe direkt darunter pipetieren und die Lösung sanft nach oben und unten pipetieren, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Zeilen, indem Sie bei jedem Schritt 100 Mikroliter von der vorherigen Zeile in die darunter stehende Zeile verschieben und fortfahren, bis die fünfte Zeile seriell verdünnt wurde. Lassen Sie die sechste Zeile nur mit zellkulturellem Medium, um als Kontrolle zu dienen. Um die Zellen in den experimentellen Brunnen der Platte zu stimulieren, fügen Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Mitogenlösung zu den zellulären Suspensionen in jedem Brunnen der Reihen eins bis fünf hinzu. Achten Sie darauf, die sechste Reihe, die als Kontrolle dienen wird, unstimuliert zu verlassen. Ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 für 24 bis 48 Stunden.

Bereiten Sie den verdünnten biotinylierten Antizytokin-Detektionsantikörper vor. Bereiten Sie zunächst 50 Milliliter Assay-Verdünnungsmittel vor, indem Sie 5 Milliliter 10% fetales Rinderserum zu 45 Milliliter PBS hinzufügen. Als nächstes verdünnen Sie den nachweisbaren Antikörper auf eine Konzentration von 2 Mikrogramm pro Milliliter in Assay-Verdünnungsmittel. Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt außerdem 20 bis 25 Milliliter Waschpuffer vor, indem Sie 0,05 % Tween-20 und PBS mischen.

Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte und kehren Sie sie schnell um, um alle Flüssigkeit aus den Brunnen zu entfernen. Waschen Sie die Platte, indem Sie jedem Brunnen etwa 200 Mikroliter Waschpuffer hinzufügen. Vertreiben Sie diese Flüssigkeit, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle flicken. Wiederholen Sie diesen Vorgang vier weitere Male für insgesamt fünf Wähbe. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Detektions-Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu, ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Nach der Inkubation die Detektions-Antikörperlösung aus den Plattenbrunnen vertreiben, indem Sie die Platte umkehren und über das Waschbecken flicken.

Waschen Sie die Platte wie bisher fünfmal mit Waschpuffer und vertreiben Sie die Flüssigkeit zwischen den einzelnen Waschanlagen. Nach der letzten Wäsche die Streptavidin- Meerrettich-Peroxidase-Lösung vorbereiten, indem Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen. Als nächstes, mit den Brunnen der Platte leer, fügen Sie 100 Mikroliter verdünnt Streptavidin- Meerrettich Peroxidase Lösung zu jedem Brunnen. Legen Sie den Deckel wieder auf die Platte und brüten Sie bei Raumtemperatur für zwei Stunden.

Aktivieren Sie nach der Inkubation nicht mehr als 15 Minuten vor Gebrauch die vorgefertigte AEC-Substratlösung. Entsorgen Sie den Inhalt der Brunnen und waschen Sie den Teller fünfmal mit Waschpuffer, wie zuvor. Dann sofort 100 Mikroliter vorbereitete AEC Substratlösung in jeden Brunnen geben. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für etwa 10 bis 20 Minuten entwickeln, während die Spot-Entwicklung zu überwachen. Diese Flecken erscheinen als kleine, abgedunkelte Kreise auf der Oberfläche der Brunnen. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie die Platte mit Wasser abspülen und über das Waschbecken streicheln. Die Platte auf Papiertücher naugen und über Nacht oder bis zum Trocknen trocknen lassen. Das Entfernen der Kunststoffschale unter der Platte erleichtert das Trocknen. Nach dem Trocknen können die Spots mit einem automatisierten Plattenleser gezählt werden.

Hier wird der CTL ImmunoSpot Reader verwendet, aber dieses Protokoll kann für jeden Leser angepasst werden. Öffnen Sie dann das CTL-Programm und klicken Sie auf Scan Count. Drücken Sie den Auswurf für das Fach, um sich von der Maschine zu erstrecken. Entfernen Sie dann den Kunststoffadapter, und richten Sie Zeile A auf der ELISPOT-Platte und dem ADAPTER aus. Wählen Sie einen Dateinamen und Speicherort für die zu speichernde Datei aus, und laden Sie die Platte und den Adapter auf das Fach. Klicken Sie auf die Software laden und schließen Sie die Tür auf der Seite der Maschine. Drücken Sie dann Start after Counting. Stellen Sie sicher, dass die Datei gespeichert ist, und öffnen Sie dann die QC-Software Qualitätskontrolle, um die Daten zu analysieren und die Anzahl der Spots zu zählen. Exportieren Sie diese Daten als Excel-Datei. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf Auswerfen, um die Platte abzurufen.

In diesem Experiment wurden Zellen von Wildtyp und tumortragenden Mäusen plattiert und auf IFN-Gamma analysiert. Beachten Sie, dass die Anzahl der Flecken mit abnehmender Zellkonzentration abnimmt. In der Regel werden ELISPOT-Daten als Anzahl der Spotzahlen pro Anzahl der plattierten Zellen dargestellt. In diesem Beispiel wurde die Anzahl der Spots in einem Balkendiagramm angezeigt, wobei die jeweilige Zellkonzentration auf der x-Achse aufgeführt ist. Beachten Sie, dass die Anzahl der Spots die Anzahl der aktivierten Zellen pro Gesamtzahl der Zellen in einer bestimmten Grundgesamtheit angibt.

Results

In diesem ELISPOT-Assay wurden milden Leukozyten von Wildtyp- und tumortragenden Mäusen auf IFN-A analysiert. Abbildung 2 A zeigt das visuelle Bild des Assay-Ergebnisses. Die Zahlen in der grünen Farbe geben die Anzahl der Flecken pro Bohrkörper an (TNTC gibt "zu zahlreich an, um zu zählen"). Beachten Sie, dass die Anzahl der Flecken mit abnehmender Zellkonzentration abnimmt.

Figure 2A
Abbildung 2A: Verminderte Immunantworten bei tumortragenden Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In der Regel werden ELISPOT-Daten als Anzahl der Spotzahlen pro Anzahl der plattierten Zellen dargestellt. In Abbildung 2 B wird die Anzahl der Flecken in einem Balkendiagramm angezeigt, wobei die jeweilige Zellkonzentration auf der X-Achse aufgeführt ist. Für Graphikzwecke wurde 150 verwendet, um die maximale Anzahl von Spots anzugeben. Die Zahl der IFN--N, die murine Milzleukozyten bei tumortragenden Tieren produzieren, ist geringer als die der wilden Tiere.

Figure 2B
Abbildung 2B: Verminderte Immunantworten bei tumortragenden Mäusen. Splenozyten wurden von der Kontrolle C57BL/6 (Wildtyp) und tumortragenden Mäusen geerntet und 48 Stunden lang mit PMA/Ionomycin stimuliert. ELISPOT-Assays wurden verwendet, um die Anzahl der IFN--produzierenden Milzleukozyten zu quantifizieren. (A) Visuelle und (B) grafische Darstellung der Daten. TNTC gibt an, dass zu zahlreich gezählt werden kann. Für Graphikzwecke wurde 150 verwendet, um die maximale Anzahl von Spots anzugeben. Die grünen Zahlen geben die Anzahl der gezählten Spots pro Brunnen an. Die roten Zahlen geben die Referenzbrunnen an, die verwendet wurden, um zu bestimmen, welche Flecken Zellen waren und welche Flecken Trümmer, Artefakte oder Kanteneffekte waren und von der Analyse ausgeschlossen werden sollten.

Applications and Summary

Der ELISPOT-Assay ermöglicht es, die Aktivierung von Immunzellen zu bewerten, indem die Anzahl der Zellen bestimmt wird, die einen bestimmten Analyten absondern. Die Größe und Intensität der Flecken gibt Auskunft über die Menge an Analyt, die von jeder Zelle produziert wird. Das oben beschriebene Protokoll beschreibt den Nachweis eines einzelnen Zytokins. Die jüngsten Entwicklungen haben jedoch den Nutzen dieses Assays verbessert. Derzeit kann man fluoreszierende Detektionsfarbstoffe verwenden, um mehrere Analyten in einem Brunnen zu erkennen. Dies ermöglicht die Detektion verschiedener Subpopulationen von Zellen, die entweder ein oder beide Analyten absondern.

References

  1. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., & Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods, 65 (1), 109-121(1983).
  2. Wahid, R., Simon, J. K., Picking, W. L., Kotloff, K. L., Levine, M. M., & Sztein, M. B. Shigella antigen-specific B memory cells are associated with decreased disease severity in subjects challenged with wild-type Shigella flexneri 2a. Clinical Immunology, 148 (1), 35-43 (2013).
  3. Roberts, T. J., Lin, Y., Spence, P. M., Van Kaer, L., & Brutkiewicz, R. R. CD1d1-dependent control of the magnitude of an acute antiviral immune response. The Journal of Immunology, 172, 3454-3461 (2004).

1. Einrichtung

Puffer und Reagenzien

  1. Sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) ohne Calcium oder Magnesium
  2. Beschichtungspuffer - entweder steriles PBS oder Karbonatpuffer
  3. Assay Verdünner - 10% fetales Rinderserum (FBS) in PBS
  4. Zellkultur mittel- RPMI 1640 mit 10% FBS, Penicillin/Streptomycin, & L-Glutamin
  5. Waschpuffer- PBS mit 0,05% Tween20
  6. Doppelt destilliertes Wasser (ddH2O)
  7. Nachweis substrat- 100 mg AEC (3-Amino-9-ethyl-carbazol) in 10 ml DMF (N,N, Dimethylformamid).

ausrüstung

  1. Laminare Durchflusshaube
  2. Befeuchtter Inkubator (eingestellt auf 37°C, 5% CO2)
  3. Automatisiertes ELISPOT-Lesegerät oder Sezieren von Mikroskop

Materialien

  1. ELISPOT-Platten
  2. Sterile und nichtsterile Reservoirs
  3. Pipettierer und Spitzen
  4. Sterile serologische Pipetten
  5. Sterile, konische Polypropylenrohre
  6. Zwei Squeeze-Flaschen zum Plattenwaschen

Assay Spezifische Reagenzien

  1. Zellen - Primärzellen oder Zelllinien (hier wurden Splenozyten von C57BL/6-Mäusen verwendet)
  2. Stimulanzien- Mitogen oder Antigen (hier wurden phorbol 12-Myristate 13-Acetat (PMA, 50 ng/ml) und Ionomycin (1 m) verwendet)
  3. Primärer Antikörper- biotinylatierter Antizytokin-Detektionsantikörper (verdünnt auf 2 g/ml in Assay-Verdünnungsmittel)
  4. Sekundäre Antikörper- Streptavidin-Meerrettichperoxidase (SAv-HRP)

2. Verfahren

überzug

  1. Um die Bedingungen steril und in einer laminaren Durchflusshaube zu halten, verdünnen Sie den gereinigten Antizytokin-Capture-Antikörper auf eine Endkonzentration von 0,5-4,0 g/ml im sterilen Beschichtungspuffer. (Hinweis: für IFN- - und IL-6 verwenden Sie 5 g/ml).
  2. Übertragen Sie die Capture-Antikörperlösung, 100 l/well, auf die ELISPOT-Platte.
  3. Bedecken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung und versiegeln Sie sie, um Verdunstung zu verhindern.
  4. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4°C.

Blockieren

  1. Am nächsten Tag entdecken Sie die ELISPOT-Platte in der laminaren Strömungshaube. Um die Platte schnell auf sterile Tücher umzukehren, um die Capture-Antikörperlösung aus jedem Brunnen zu entfernen.
  2. Fügen Sie dann jedem Brunnen 200 L Zellkulturmedium hinzu. Dieser Schritt blockiert die unspezifische Bindung während des Testes.
  3. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie die Platte für 2 Stunden bei 37°C.

Beschichtungs- und Aktivierungszellen

  1. Während der Inkubation der Platte, bereiten Sie eine 2X Mitogen-Lösung mit 50 ng/ml PMA und 1 M Ionomycin in Zellkultur Medium.
  2. Bereiten Sie dann Zielzellsuspensionen auf eine Lagerkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml vor.
  3. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Zellkulturmedium aus jedem Brunnen, indem Sie die Platte schnell auf sterile Tücher in der laminaren Strömungshaube umkehren.
  4. Als Nächstes generieren Sie eine 2x serielle Verdünnung der Stammzellsuspensionslösung. Dazu fügen Sie zunächst 200 l der vorbereiteten zellulären Suspensionsstocklösung in die Brunnen in der oberen Reihe der ELISPOT-Platte ein.
  5. Fügen Sie dann 100 L des mediums einfache Zellkultur zu den nächsten fünf Reihen der Platte unter den Reihen hinzu, die eine zelluläre Stammlösung enthalten.
  6. Führen Sie danach eine 2-fache serielle Verdünnung durch, indem Sie 100 l der Zellsuspension aus der oberen Reihe in die Reihe direkt darunter pipetieren. Sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Durchmischung, indem Sie diese Lösung vorsichtig nach oben und unten pipetieren, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
  7. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden vier Zeilen.
  8. Lassen Sie die sechste Reihe nur mit dem Kulturmedium. Es wird als experimentelle Kontrolle dienen.
  9. Als nächstes fügen Sie 100 l der vorbereiteten Mitogenlösung in die Versuchsbrunnen der ersten fünf Reihen der Platte ein. In den Kontrollbrunnen und der sechsten Reihe fügen Sie 100 L der Zellkulturmedien ohne Mitogen hinzu.
  10. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Platte bei 37°C, 5%CO2 in einem Inkubator für 20-48 Stunden. (Hinweis: 20-24 Stunden sind in der Regel ausreichend, um IL-2 und TNF- zu erkennen, während 48 Stunden optimal für IL-4 und IFN-A sind).

entdeckung

Primärer Antikörper

  1. Bereiten Sie den biotinylierten Antizytokin-Detektionsantikörper auf eine Konzentration von 2 g/ml in Assay-Verdünnungsmittel vor.
  2. Bereiten Sie 20-25 ml Waschpuffer zu diesem Zeitpunkt durch Mischen von 0,05% Tween-20 in PBS.
  3. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entkappen Sie die Platte und kehren Sie sie schnell über eine Spüle um, um alle Flüssigkeit aus den Brunnen zu entfernen. (Hinweis: Nach diesem Punkt muss die Platte nicht mehr steril gehalten werden).
  4. Dann waschen Sie die Platte, indem Sie jedem Brunnen einen Waschpuffer von 200 L hinzufügen. Vertreiben Sie diese Flüssigkeit, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle flicken. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt fünf Wähbe.
  5. Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 100 l der verdünnten biotinylierten Antizytokin-Erkennungslösung hinzu. Bei Raumtemperatur 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.

Sekundärer Antikörper

  1. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, vertreiben Sie den Detektionsantikörper, indem Sie die Platte umkehren und über das Waschbecken flicken.
  2. Waschen Sie die Platte wie bisher 5 Mal mit einem Waschpuffer von 200 l, wodurch die Flüssigkeit zwischen den einzelnen Waschanlagen ausgegart ist.
  3. Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 100 l verdünnte Streu-Meerrettich-Peroxidase-Lösung hinzu (verdünnt auf ihre vorbestimmte optimale Konzentration im Assay-Verdünnungsmittel).
  4. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 1,5-2 Stunden bei 37°C.

Substrat

  1. Nach der Inkubation, nicht mehr als 15 Minuten vor Gebrauch, aktivieren Sie zuerst AEC Substratlösung nach Herstelleranweisungen.
  2. Als nächstes entsorgen Sie den Inhalt der Brunnen und waschen Sie die Platte fünfmal mit Waschpuffer, wie zuvor.
  3. Dann fügen Sie sofort 100 l vorbereitete AEC-Substratlösung in jeden Brunnen ein.
  4. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10-20 Minuten, während Sie die Punktentwicklung überwachen.
  5. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Platte mit Wasser abspülen und die Platte über das Waschbecken streichen.
  6. Bloten Sie die Platte auf Papiertücher und lassen Sie die Platte über Nacht trocknen oder bis sie vollständig trocken ist. Das Entfernen der Kunststoffschale unter der Platte erleichtert das Trocknen.

3. Datenerfassung und -analyse

  1. Nach dem Trocknen können die Spots mit einem automatisierten Plattenleser gezählt werden. Hier wird der CTL Immunospot Reader verwendet, aber dieses Protokoll kann für jeden Leser angepasst werden.
  2. Schalten Sie zuerst das Gerät ein, dann den Computer. Öffnen Sie dann das CTL-Programm und klicken Sie auf "Scananzahl".
  3. Drücken Sie "Auswurf" für das Fach, um sich von der Maschine zu erstrecken. Entfernen Sie dann den Kunststoffadapter und richten Sie die Reihe "A" auf der ELISPOT-Platte und dem Adapter aus.
  4. Wählen Sie einen Dateinamen und Speicherort für die zu speichernde Datei aus, und laden Sie die Platte auf das Fach.
  5. Klicken Sie dann auf "Laden" auf die Software und schließen Sie die Tür auf der Seite der Maschine.
  6. Drücken Sie "Start- nach dem Zählen". Stellen Sie sicher, dass die Datei gespeichert ist, und öffnen Sie dann die Software "QC" der Qualitätskontrolle, um die Daten zu analysieren und die Anzahl der Spots zu zählen.

Notizen:

  1. Die Mindestanzahl der Zellen sollte in Vorversuchen bestimmt werden. Die optimale Anzahl von Spots ist 50 €/gut. Wenn zu viele Zellen geladen werden, ist es schwierig, einzelne Stellen zu erkennen. Darüber hinaus überlappen sich die Zellen und bilden möglicherweise keine Monoschicht auf der Membran, so dass der Nachweisgrad reduziert werden kann.
  2. Berücksichtigen Sie bei der Optimierung des Experiments den erwarteten Expressionsgrad des Zielproteins. Je niedriger der Ausdruck, desto höher ist die Anzahl der Zellen, die pro Bohrkörper benötigt werden.
  3. Im Gegensatz zu ELISA ist es besser, die Platte von Hand zu waschen, als eine Plattenwäscherin zu verwenden. ELISPOT Platten sind empfindlicher und man sollte vermeiden, die PVDF-Membran zu punktieren.
  4. Man sollte die Bewegung der Platte während der Inkubationszeit begrenzen, da es dazu führen kann, dass die Flecken verschmieren.
  5. Platten sollten im Dunkeln gelagert werden, da die Exposition gegenüber direktem Licht dazu führt, dass Flecken verblassen.

Der enzymgebundene Immunospot, oder ELISPOT, Assay ist eine Methode, um die Immunantwort auf einen Erreger oder Zellschäden zu analysieren. Es ermöglicht die Quantifizierung der Aktivierung verschiedener Immunzellen durch den Nachweis bestimmter Proteine, die sie absondern. Beispielsweise wird ELISPOT häufig zur Messung von T-Zell-Antworten bei Exposition gegenüber einem fremden Antigen verwendet, indem sezernierte Zytokine erkannt werden.

Für einen auf Zytokin basierenden ELISPOT-Test beginnt der Prozess mit der Beschichtung einer ELISPOT-Mikroplatte mit einem Capture-Antikörper, der spezifisch für das Zielzytokin ist. Nach der Antikörperbeschichtung werden den Brunnen T-Zellen zugesetzt und durch einen externen Wirkstoff, wie z.B. Anti-CD3-Antikörper, stimuliert. Die Zellen sezernieren dann das Zielzytokin, das sofort durch den Capture-Antikörper immobilisiert wird. Da das Protein sofort nach der Sekretion aus lebenden Zellen ohne Verdünnung oder Abbau gefangen wird, hat dieser Test eine hohe Genauigkeit. Nachdem das Zielzytokin immobilisiert wurde, wird ein Detektionsantikörper hinzugefügt, der auch an das gefangene Zytokin bindet.

Die ELISPOT-Technik kann auch verwendet werden, um Gedächtnis-B-Zellen nach einer Infektion oder Impfung zu quantifizieren, indem ihre Produktion von spezifischen Antikörpern analysiert wird. In einem Antikörper-basierten ELISPOT wird ein spezifisches Antigen anstelle eines Antikörpers entweder für den Erfassungsschritt verwendet, bei dem das Antigen an die Platte gebunden wird, oder beim Detektionsschritt, bei dem das Antigen den Zielantikörper nach der Erfassung erkennt. In allen Variationen des Prozesses, bei T-Zellen oder B-Zellen, ist der Nachweisantikörper oder Antigen biotinyliert, was es ermöglicht, an ein Streptavidin-konjugiertes Detektionsenzym wie Meerrettichperoxidase zu binden. Dann wird nach Zugabe des Substrats der Peroxidase, AEC, ein dunkler, unlöslicher Niederschlag erzeugt. Dieser Niederschlag markiert die Position des gefangenen Proteins, und jede sekretorische Zelle ergibt einen sichtbaren Punkt, der mit einem ELISPOT-Reader oder einem Mikroskop quantifiziert werden kann. Die Größe der Flecken ist eine relative Schätzung der Menge an Protein, die von jeder Zelle abgesondert wird. Dieser Test kann Immunantworten von einzelnen Zellen erkennen, selbst in relativ kleinen Subpopulationen von sekretonischen Zellen, was es nützlich für die Untersuchung von Immunantworten auf zellulärer Ebene macht.

In diesem Video erfahren Sie, wie Sie einen ELISPOT-Test durchführen und dann die Flecken quantifizieren, die die Sekretorien darstellen.

Während des gesamten Experiments, sorgen Sie für sterile Bedingungen, indem Sie in einer laminaren Strömungshaube arbeiten und Handschuhe tragen.

Alle Berechnungen in diesem Protokoll basieren auf dem Volumen, das für eine 96-Well-Platte benötigt wird.

Verdünnen Sie zunächst den Antizytokin-Capture-Antikörper. Um dies zu tun, übertragen Sie 10 Milliliter Puffer in eine sterile 15 Milliliter konische Röhre. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 10 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter monoklonalen Antikörper in den Puffer zu geben, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erstellen. Als nächstes gießen Sie die Capture-Antikörperlösung in ein steriles Reservoir und verteilen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter in jeden Brunnen einer 96-Well-ELISPOT-Platte.

Bedecken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung, versiegeln Sie sie, um Verdunstung zu verhindern, und bebrüten Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag entdecken Sie die ELISPOT-Platte in der laminaren Strömungshaube. Um die Platte schnell auf sterile Tücher umzukehren, um die Capture-Antikörperlösung aus jedem Brunnen zu entfernen. Als Nächstes verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jedem Brunnen 200 Mikroliter Zellkulturmedium hinzuzufügen. Dieser Schritt blockiert die unspezifische Bindung während des Testes. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie in einem 37 Grad Celsius Inkubator für zwei Stunden.

Während die Platte inkubiert, bereiten Sie eine 2X Mitogenlösung vor, indem Sie einen Mikroliter PMA und 20 Mikroliter Ionomycin zu 10 Milliliter Zellkulturmedium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 15 Nanogramm pro Milliliter PMA und ein Mikromolarionomycin zu erreichen.

Zelluläre Suspensionen von Maus-Splenozyten sollten zu diesem Zeitpunkt auch in einer sterilen Haube zubereitet werden. Mit Einem Mikroskop und Hämozytometer messen Sie die Konzentration der Zellen und passen Sie das Gesamtvolumen an, bis eine Bestandskonzentration von zwei Millionen Zellen pro Milliliter erreicht ist.

Nach der Inkubation ist die Platte schnell auf sterile Tücher umgedreht, um das Zellkulturmedium aus jedem Brunnen zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter der vorbereiteten zellulären Suspensionsstocklösung in die Brunnen in der oberen Reihe der ELISPOT-Platte ein. Richten Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung ein, sodass jeder getestete Zelltyp in einen Satz von drei gruppierten Spalten eingeteilt wird. Darunter fügen Sie 100 Mikroliter einfache Zellkultur Medium zu den nächsten fünf Reihen der Platte, unter den Reihen mit zellulären Stock Lösung.

Als nächstes führen Sie eine serielle Verdünnung durch, indem Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension aus der oberen Reihe in die Reihe direkt darunter pipetieren und die Lösung sanft nach oben und unten pipetieren, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Zeilen, indem Sie bei jedem Schritt 100 Mikroliter von der vorherigen Zeile in die darunter stehende Zeile verschieben und fortfahren, bis die fünfte Zeile seriell verdünnt wurde. Lassen Sie die sechste Zeile nur mit zellkulturellem Medium, um als Kontrolle zu dienen. Um die Zellen in den experimentellen Brunnen der Platte zu stimulieren, fügen Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Mitogenlösung zu den zellulären Suspensionen in jedem Brunnen der Reihen eins bis fünf hinzu. Achten Sie darauf, die sechste Reihe, die als Kontrolle dienen wird, unstimuliert zu verlassen. Ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 für 24 bis 48 Stunden.

Bereiten Sie den verdünnten biotinylierten Antizytokin-Detektionsantikörper vor. Bereiten Sie zunächst 50 Milliliter Assay-Verdünnungsmittel vor, indem Sie 5 Milliliter 10% fetales Rinderserum zu 45 Milliliter PBS hinzufügen. Als nächstes verdünnen Sie den nachweisbaren Antikörper auf eine Konzentration von 2 Mikrogramm pro Milliliter in Assay-Verdünnungsmittel. Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt außerdem 20 bis 25 Milliliter Waschpuffer vor, indem Sie 0,05 % Tween-20 und PBS mischen.

Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte und kehren Sie sie schnell um, um alle Flüssigkeit aus den Brunnen zu entfernen. Waschen Sie die Platte, indem Sie jedem Brunnen etwa 200 Mikroliter Waschpuffer hinzufügen. Vertreiben Sie diese Flüssigkeit, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle flicken. Wiederholen Sie diesen Vorgang vier weitere Male für insgesamt fünf Wähbe. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Detektions-Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu, ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Nach der Inkubation die Detektions-Antikörperlösung aus den Plattenbrunnen vertreiben, indem Sie die Platte umkehren und über das Waschbecken flicken.

Waschen Sie die Platte wie bisher fünfmal mit Waschpuffer und vertreiben Sie die Flüssigkeit zwischen den einzelnen Waschanlagen. Nach der letzten Wäsche die Streptavidin- Meerrettich-Peroxidase-Lösung vorbereiten, indem Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen. Als nächstes, mit den Brunnen der Platte leer, fügen Sie 100 Mikroliter verdünnt Streptavidin- Meerrettich Peroxidase Lösung zu jedem Brunnen. Legen Sie den Deckel wieder auf die Platte und brüten Sie bei Raumtemperatur für zwei Stunden.

Aktivieren Sie nach der Inkubation nicht mehr als 15 Minuten vor Gebrauch die vorgefertigte AEC-Substratlösung. Entsorgen Sie den Inhalt der Brunnen und waschen Sie den Teller fünfmal mit Waschpuffer, wie zuvor. Dann sofort 100 Mikroliter vorbereitete AEC Substratlösung in jeden Brunnen geben. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für etwa 10 bis 20 Minuten entwickeln, während die Spot-Entwicklung zu überwachen. Diese Flecken erscheinen als kleine, abgedunkelte Kreise auf der Oberfläche der Brunnen. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie die Platte mit Wasser abspülen und über das Waschbecken streicheln. Die Platte auf Papiertücher naugen und über Nacht oder bis zum Trocknen trocknen lassen. Das Entfernen der Kunststoffschale unter der Platte erleichtert das Trocknen. Nach dem Trocknen können die Spots mit einem automatisierten Plattenleser gezählt werden.

Hier wird der CTL ImmunoSpot Reader verwendet, aber dieses Protokoll kann für jeden Leser angepasst werden. Öffnen Sie dann das CTL-Programm und klicken Sie auf Scan Count. Drücken Sie den Auswurf für das Fach, um sich von der Maschine zu erstrecken. Entfernen Sie dann den Kunststoffadapter, und richten Sie Zeile A auf der ELISPOT-Platte und dem ADAPTER aus. Wählen Sie einen Dateinamen und Speicherort für die zu speichernde Datei aus, und laden Sie die Platte und den Adapter auf das Fach. Klicken Sie auf die Software laden und schließen Sie die Tür auf der Seite der Maschine. Drücken Sie dann Start after Counting. Stellen Sie sicher, dass die Datei gespeichert ist, und öffnen Sie dann die QC-Software Qualitätskontrolle, um die Daten zu analysieren und die Anzahl der Spots zu zählen. Exportieren Sie diese Daten als Excel-Datei. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf Auswerfen, um die Platte abzurufen.

In diesem Experiment wurden Zellen von Wildtyp und tumortragenden Mäusen plattiert und auf IFN-Gamma analysiert. Beachten Sie, dass die Anzahl der Flecken mit abnehmender Zellkonzentration abnimmt. In der Regel werden ELISPOT-Daten als Anzahl der Spotzahlen pro Anzahl der plattierten Zellen dargestellt. In diesem Beispiel wurde die Anzahl der Spots in einem Balkendiagramm angezeigt, wobei die jeweilige Zellkonzentration auf der x-Achse aufgeführt ist. Beachten Sie, dass die Anzahl der Spots die Anzahl der aktivierten Zellen pro Gesamtzahl der Zellen in einer bestimmten Grundgesamtheit angibt.

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

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