纯培养和条纹电镀:从混合样品中分离单一细菌菌落

Microbiology

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Concepts

资料来源:蒂尔德·安徒森1号,罗尔夫·卢德1
1临床科学隆德系,感染医学系,生物医学中心,隆德大学,221 00 隆德,瑞典

似乎无法确定,微生物生物多样性确实令人震惊,估计有一万亿种物种并存(1,2)。虽然气候特别恶劣,如人类胃的酸性环境(3)或南极洲的冰下湖泊(4),可能由特定物种主导,但细菌通常存在于混合培养物中。由于每种菌株都可能影响另一种(5)的生长,分离和培养"纯"(仅包含一种类型)菌落的能力在临床和学术环境中都变得至关重要。纯培养能进一步进行遗传(6)和蛋白细胞学检查(7),分析样品纯度,也许更值得注意的是,从临床样本中鉴定和鉴定传染性病原体。

细菌具有广泛的生长要求,有许多类型的营养介质,旨在维持不苛求和挑剔的物种 (8)。生长介质可以以液体形式(作为肉汤)或以典型的琼脂基(一种从红藻中提取的凝胶剂)固体形式制备。直接接种到肉汤有产生基因多样性甚至混合细菌群的风险,电镀和再循环创造了一种更纯净的培养,每个细胞都有高度相似的遗传组成。条纹板技术基于样品的逐行稀释(图1),目的是将单个细胞彼此分离。任何由介质和指定环境维持的存活细胞(以下简称细胞形成单元,CFU)随后可以通过二元裂变找到孤立的子细胞群落。尽管细菌群落内突变率很快,但通常认为该细胞群为克隆细胞。因此,采集和重新采集这一种群可确保后续工作只涉及一种细菌类型。

Figure 1
图1:条纹板基于原始样品的逐行稀释。I)接种最初使用锯齿形运动进行分散,从而形成细菌相对密集的区域。II-IV)条纹从前面的区域绘制,每次使用无菌接种循环,直到达到第四个象限。V)最后一个指向板块中间的锯齿状运动形成了一个区域,其中接种已明显稀释,使菌落彼此分开出现。

条纹板技术也可以与选择性和/或差分介质的使用相结合。选择性培养基会抑制某些生物体的生长(例如通过添加抗生素),而差别培养基将仅有助于区分另一种(例如,通过血液琼脂板上的溶血)。

微生物学的所有工作的基础是使用无菌(无菌)技术。每种细菌培养物都应被视为潜在的致病性,因为存在危险菌株意外生长、气溶胶形成和设备/人员污染的风险。为了尽量减少这些风险,所有介质、塑料、金属和玻璃器皿通常在使用前后通过高压灭菌进行灭菌,使其在 121°C 左右受到高压饱和蒸汽的影响,从而有效清除任何残留的细胞。工作空间通常在使用之前和之后使用乙醇进行消毒。在与传染性病原体一起工作时,始终佩戴实验室外套和手套。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 微生物学. 纯培养和条纹电镀:从混合样品中分离单一细菌菌落. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. 设置

  1. 所有微生物都应被视为危险。始终穿着实验室外套和手套,系回长发,并确保任何伤口都特别有保护。
  2. 使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒,为工作空间做好准备。
  3. 确保琼脂板、样品溶液和一盒预消毒塑料接种回路或金属环加 Bunsen 火焰在手。一次性塑料回路通常经过预消毒。金属环应浸入70%乙醇中,然后保持在Bunsen火焰的蓝色区域附近,加热至热热。通过抬起板盖(仅防止污染)并敲击钢丝与凝固介质,让导线冷却。
  4. 完成每个步骤,反复消毒工作空间,彻底清洗/消毒手和手腕。

2. 议定书

  1. 媒体的准备
    1. 识别和制备固体介质(通常含有1.5%(w/v)琼脂),以维持被利用的细菌物种/菌株。将介质混合在瓶中,可保持最终体积的两倍,以避免高压灭菌时溢出。
    2. 将瓶盖半紧,置于设定为 121°C 的高压灭菌器中,20 分钟,对介质进行消毒。
    3. 一旦从高压灭菌器中取出瓶子,立即正确关闭瓶盖。如果即将使用介质,将瓶子置于 45°C 的水浴中,以保持其液态。否则,琼脂将在低于 32-40°C 的温度下凝固,以后可重新加热(通常使用微波)至 85°C 的熔点。
  2. 文化板块的准备
    1. 将无菌培养皿(通常为 100 x 15 mm)的底座(通常为 100 x 15 mm)标记在侧面或底部,并标记实验者的姓名、日期和媒体类型。
    2. 将 45°C 琼脂培养基的 20-25 mL(以前准备)倒入每个标记板中。如果泡沫沿边缘出现,应使用常规移液器和无菌尖端快速清除。
    3. 立即将所有盖子放回盘子上,以防污染。
    4. 让琼脂在室温下凝固约2小时,或在4°C下过夜。一旦设置,细菌培养板随后应倒置在4°C,以尽量减少在介质表面的冷凝。
  3. 条纹电镀
    1. 将无菌回路浸入所需的接种中,并立即使用锯齿形运动将收集的样品分散到板的第一象限上(图1,I)。
    2. 关闭盖子并重新消毒接种回路或收集新的无菌一次性循环。
    3. 使 3-4 笔画从第一象限(包含相对密集的细菌群)向板的第二象限辐射(图 1,II)。
    4. 关闭盖子,重新消毒接种回路或丢弃一次性循环,并收集一个新的无菌循环。
    5. 重复从第二个象限到第三象限的3-4个冲程,然后从第三个象限到第四象限,每次使用无菌循环(图1,III-IV)。
    6. 使用无菌循环,从第四象限到板的中间以锯齿形模式进行最后一次冲程(图 1,V)。该地区的细菌患病率将较低,理想情况下允许从单个、可行的母细胞建立单个菌落。
    7. 用副膜合上盖子和(如果细菌物种需要)密封,以防止气流。
    8. 根据细菌种类/菌株的不同,将培养板向上一侧置于适当的环境中,孵育,直到细菌菌落可见(分离的菌落可以出现在板的任意一个区域,因为初始浓度可能有所不同)。
    9. 要产生克隆细菌群,将另一个板划出,将镀在原板上的接种液交换从原始板的单个菌群中分离出来的细胞。

在培养皿中,如果一种细菌经历多轮无性繁殖,将导致克隆菌群的形成。然而,从混合样品(如土壤悬浮液)获得单个细菌可能很困难。如果这种异质文化被一循环地接受,它可以包含多达一万亿个单个细菌。为了将这么多细菌传播到琼脂板的表面,获得单个菌落,即使使用锯齿形图案,循环也需要连续拖动到足够多的板块的表面并排设置,以包围整个自由岛。显然,科学家并没有真正使用那么多的盘子。相反,他们使用一种称为条纹电镀的技术。

条纹板技术基于细菌样品的逐行稀释,并在单个培养皿的固体介质表面执行。首先,介质表面在视觉上分为五个部分,将圆周的四个片段指定为前四个部分,将板块的中心作为第五个部分。这将有效地创建五个媒体板出一个单一的培养皿。接下来,使用所需的接种循环,使用锯齿形图案对第一部分进行条纹。然后,要么使用新的一次性环路,或者在电线环路的情况下,它用Bunsen燃烧器消毒,燃烧,直到它沿电线的长度红热。这种使用新的循环,或火焰灭菌循环,去除任何剩余的细菌细胞,帮助稀释细菌。然后,热循环在空气中冷却几秒钟,然后被拖过第一部分,形成三到四条单独的线,每条线只携带一小部分细菌进入第二部分。其余部分以相同的方式条纹,每次使用无菌循环,并穿过前一条条纹。

使用这种条纹和消毒循环,应稀释后续部分的细菌浓度,以便最后部分仅包含几个离散定位的细菌。孵化后,这些离散细菌繁殖产生亚细胞的分离克隆菌落,称为菌落形成单位,或CFU。这些可以收获和重新采摘,以确保后续工作只涉及一种细菌类型,称为纯培养物。除了将单菌落从混合细菌培养物中分离外,条纹电镀技术还用于选择介质特异性菌株、确定细菌菌群形态或识别不同的细菌种类。在本视频中,我们将演示如何通过条纹电镀技术从混合细菌样品悬浮液中分离出单细菌菌落。

首先,戴上实验室手套和实验室外套。接下来,使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒。接下来,选择一个合适的介质,以维持被利用的细菌物种或菌株,并开始准备培养物。在这里,常见的LB琼脂是通过称出10克预配方,粉末介质和7.5克琼脂。将称重、干燥的组件添加到玻璃瓶中,该玻璃瓶可容纳两倍的最终体积,以避免溢出。然后,在瓶子里加入500毫升的水,然后半紧闭盖上。将瓶子放入摄氏121度的高压灭菌器中,进行20分钟的消毒。完成后,使用防热手套或热垫从机器上取下介质,然后立即拧紧瓶盖将其紧紧合住。

对于当天使用,让介质冷却,将瓶子放入加热到约 45 摄氏度的水浴中,以保持介质处于液态状态。或者,介质可以在室温下储存在固态状态下。必要时,用盖子稍微打开的瓶子微波以熔化介质,并使用 45 摄氏度的水浴让介质冷却。

接下来,拿一套无菌培养皿,并带有永久标记,用调查员和媒体名称以及日期标记。然后,将所需的介质体积转移到无菌容器中,并在必要时添加抗生素或其他敏感成分。在这里,50毫升的介质与100微升的卡那霉素混合,最终浓度为每毫升25微克。旋转管,以确保在整个介质中均匀分布添加的部件。慢慢地,为了避免气泡形成,将20至25毫升约45摄氏度的培养介质倒入每个板中。如果出现气泡或泡沫,请使用常规移液器和无菌尖端快速清除。然后,立即更换所有盖子以防止污染。让琼脂在室温下凝固至少两小时或过夜。凝固后,将培养板倒置在四摄氏度,以尽量减少介质表面的冷凝。

要条纹文化选择,首先采取一个干净的文化板,并删除盖子。快速工作,将一次性无菌循环浸入所需的接种中,然后立即使用锯齿形运动将环拭过板的第一象限。更换盘子的盖子,丢弃用过的接种回路,然后选择一个新的无菌循环。使用新的循环,使三到四个笔画跨越从第一象限辐射的原始拭子线,该象限应包含相对密集的细菌群进入第二象限。再次关闭盖子,并丢弃循环。使用新循环时,再次重复此操作,但这次从第二个象限进入第三个象限。然后,再次使用新的循环,从第三段进入第四节。最后,使用新的循环,以锯齿形图案从第四象限向板中心进行最后一个描边。这一地区的细菌患病率将较低,理想情况下允许从单个活的母细胞建立单个菌落。

更换板盖,如果适合细菌种类,用底片密封板,以防止气流。将培养板倒置,以防止冷凝滴,然后放置在适当的温度进行生长。在这里,一个孵化器被设置为37摄氏度。让板孵育,直到细菌菌落可见。要生成克隆细菌群,请从该板块中选择一个离散菌群。现在,用无菌循环,触摸目标菌落,和以前一样,在新板的第一象限中发出条纹。继续交替消毒循环,并条纹板的剩余象限,如前所述,以锯齿形到中心结束。关闭板,并将其放置以孵育,直到离散菌落形成。一旦这些菌落生长,它们通常代表纯克隆菌株。

初始条纹板可能含有来自不同细菌物种的细胞或具有不同遗传成分的细胞的菌落,具体取决于样品纯度。通过随后分离单个菌落,其中所有单位都派生自一个共同的母细胞,第二条纹程序产生相对克隆的细菌群,适合进一步表征或接种到肉汤。

Results

初始条纹板可能含有来自不同遗传成分的细胞的菌落,或(取决于样本纯度)来自不同细菌物种的菌落(图2A)。

通过随后分离单个菌落,其中所有单位都派生自一个共同的母细胞,第二条纹程序产生相对克隆的细菌群,适合进一步表征或接种到肉汤(图 2B.

Figure 2
图2:通过隔离单个、隐蔽的菌群,可以从混合样本中生成纯区域性。A)单个细菌细胞(CFU)的生长产生了一个克隆菌落,与其他物种和菌株分离。此 CFU 用于随后条纹到新的板B)第二个板,其中细菌群仅由从初始 CFU 派生的细胞组成。

Applications and Summary

在临床和学术环境中,获得和培养纯细菌菌群的能力至关重要。条纹电镀能够分离相对克隆细胞群,源自共享的CFU,在诊断期间或分离物的额外表征中可能特别感兴趣。样品被条纹到合适的琼脂营养介质上,孵育,直到菌落变得可见。一个孤立的殖民地随后被收获,并重新被刺到第二个盘子上。

References

  1. The Human Microbiome Project C. Structure, Function and Diversity of the Healthy Human Microbiome. Nature. 486:207-214. (2012)
  2. Locey KJ, Lennon JT. Scaling laws predict global microbial diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (21) 5970-5975 (2016)
  3. Skouloubris S, Thiberge JM, Labigne A, De Reuse H. The Helicobacter pylori UreI protein is not involved in urease activity but is essential for bacterial survival in vivo. Infection and Immunity. 66:4517-21. (1998)
  4. Mikucki JA, Auken E, Tulaczyk S, Virginia RA, Schamper C, Sørensen KI, Doran PT, Dugan H, Foley N. Deep groundwater and potential subsurface habitats beneath an Antarctic dry valley. Nature Communications. 6:6831. (2015)
  5. Mullineaux-Sanders C, Suez J, Elinav E, Frankel G. Sieving through gut models of colonization resistance. Nature Microbiology. 3:132-140. (2018)
  6. Fournier PE, Drancourt M, Raoult D. Bacterial genome sequencing and its use in infectious diseases. Lancet Infectious Diseases. 7:711-23 (2007)
  7. Yao Z, Li W, Lin Y, Wu Q, Yu F, Lin W, Lin X. Proteomic Analysis Reveals That Metabolic Flows Affect the Susceptibility of Aeromonas hydrophila to Antibiotics. Scientific Reports. 6:39413 (2016)
  8. Medina D, Walke JB, Gajewski Z, Becker MH, Swartwout MC, Belden LK. Culture Media and Individual Hosts Affect the Recovery of Culturable Bacterial Diversity from Amphibian Skin. Frontiers in Microbiology. 8:1574 (2017)

1. 设置

  1. 所有微生物都应被视为危险。始终穿着实验室外套和手套,系回长发,并确保任何伤口都特别有保护。
  2. 使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒,为工作空间做好准备。
  3. 确保琼脂板、样品溶液和一盒预消毒塑料接种回路或金属环加 Bunsen 火焰在手。一次性塑料回路通常经过预消毒。金属环应浸入70%乙醇中,然后保持在Bunsen火焰的蓝色区域附近,加热至热热。通过抬起板盖(仅防止污染)并敲击钢丝与凝固介质,让导线冷却。
  4. 完成每个步骤,反复消毒工作空间,彻底清洗/消毒手和手腕。

2. 议定书

  1. 媒体的准备
    1. 识别和制备固体介质(通常含有1.5%(w/v)琼脂),以维持被利用的细菌物种/菌株。将介质混合在瓶中,可保持最终体积的两倍,以避免高压灭菌时溢出。
    2. 将瓶盖半紧,置于设定为 121°C 的高压灭菌器中,20 分钟,对介质进行消毒。
    3. 一旦从高压灭菌器中取出瓶子,立即正确关闭瓶盖。如果即将使用介质,将瓶子置于 45°C 的水浴中,以保持其液态。否则,琼脂将在低于 32-40°C 的温度下凝固,以后可重新加热(通常使用微波)至 85°C 的熔点。
  2. 文化板块的准备
    1. 将无菌培养皿(通常为 100 x 15 mm)的底座(通常为 100 x 15 mm)标记在侧面或底部,并标记实验者的姓名、日期和媒体类型。
    2. 将 45°C 琼脂培养基的 20-25 mL(以前准备)倒入每个标记板中。如果泡沫沿边缘出现,应使用常规移液器和无菌尖端快速清除。
    3. 立即将所有盖子放回盘子上,以防污染。
    4. 让琼脂在室温下凝固约2小时,或在4°C下过夜。一旦设置,细菌培养板随后应倒置在4°C,以尽量减少在介质表面的冷凝。
  3. 条纹电镀
    1. 将无菌回路浸入所需的接种中,并立即使用锯齿形运动将收集的样品分散到板的第一象限上(图1,I)。
    2. 关闭盖子并重新消毒接种回路或收集新的无菌一次性循环。
    3. 使 3-4 笔画从第一象限(包含相对密集的细菌群)向板的第二象限辐射(图 1,II)。
    4. 关闭盖子,重新消毒接种回路或丢弃一次性循环,并收集一个新的无菌循环。
    5. 重复从第二个象限到第三象限的3-4个冲程,然后从第三个象限到第四象限,每次使用无菌循环(图1,III-IV)。
    6. 使用无菌循环,从第四象限到板的中间以锯齿形模式进行最后一次冲程(图 1,V)。该地区的细菌患病率将较低,理想情况下允许从单个、可行的母细胞建立单个菌落。
    7. 用副膜合上盖子和(如果细菌物种需要)密封,以防止气流。
    8. 根据细菌种类/菌株的不同,将培养板向上一侧置于适当的环境中,孵育,直到细菌菌落可见(分离的菌落可以出现在板的任意一个区域,因为初始浓度可能有所不同)。
    9. 要产生克隆细菌群,将另一个板划出,将镀在原板上的接种液交换从原始板的单个菌群中分离出来的细胞。

在培养皿中,如果一种细菌经历多轮无性繁殖,将导致克隆菌群的形成。然而,从混合样品(如土壤悬浮液)获得单个细菌可能很困难。如果这种异质文化被一循环地接受,它可以包含多达一万亿个单个细菌。为了将这么多细菌传播到琼脂板的表面,获得单个菌落,即使使用锯齿形图案,循环也需要连续拖动到足够多的板块的表面并排设置,以包围整个自由岛。显然,科学家并没有真正使用那么多的盘子。相反,他们使用一种称为条纹电镀的技术。

条纹板技术基于细菌样品的逐行稀释,并在单个培养皿的固体介质表面执行。首先,介质表面在视觉上分为五个部分,将圆周的四个片段指定为前四个部分,将板块的中心作为第五个部分。这将有效地创建五个媒体板出一个单一的培养皿。接下来,使用所需的接种循环,使用锯齿形图案对第一部分进行条纹。然后,要么使用新的一次性环路,或者在电线环路的情况下,它用Bunsen燃烧器消毒,燃烧,直到它沿电线的长度红热。这种使用新的循环,或火焰灭菌循环,去除任何剩余的细菌细胞,帮助稀释细菌。然后,热循环在空气中冷却几秒钟,然后被拖过第一部分,形成三到四条单独的线,每条线只携带一小部分细菌进入第二部分。其余部分以相同的方式条纹,每次使用无菌循环,并穿过前一条条纹。

使用这种条纹和消毒循环,应稀释后续部分的细菌浓度,以便最后部分仅包含几个离散定位的细菌。孵化后,这些离散细菌繁殖产生亚细胞的分离克隆菌落,称为菌落形成单位,或CFU。这些可以收获和重新采摘,以确保后续工作只涉及一种细菌类型,称为纯培养物。除了将单菌落从混合细菌培养物中分离外,条纹电镀技术还用于选择介质特异性菌株、确定细菌菌群形态或识别不同的细菌种类。在本视频中,我们将演示如何通过条纹电镀技术从混合细菌样品悬浮液中分离出单细菌菌落。

首先,戴上实验室手套和实验室外套。接下来,使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒。接下来,选择一个合适的介质,以维持被利用的细菌物种或菌株,并开始准备培养物。在这里,常见的LB琼脂是通过称出10克预配方,粉末介质和7.5克琼脂。将称重、干燥的组件添加到玻璃瓶中,该玻璃瓶可容纳两倍的最终体积,以避免溢出。然后,在瓶子里加入500毫升的水,然后半紧闭盖上。将瓶子放入摄氏121度的高压灭菌器中,进行20分钟的消毒。完成后,使用防热手套或热垫从机器上取下介质,然后立即拧紧瓶盖将其紧紧合住。

对于当天使用,让介质冷却,将瓶子放入加热到约 45 摄氏度的水浴中,以保持介质处于液态状态。或者,介质可以在室温下储存在固态状态下。必要时,用盖子稍微打开的瓶子微波以熔化介质,并使用 45 摄氏度的水浴让介质冷却。

接下来,拿一套无菌培养皿,并带有永久标记,用调查员和媒体名称以及日期标记。然后,将所需的介质体积转移到无菌容器中,并在必要时添加抗生素或其他敏感成分。在这里,50毫升的介质与100微升的卡那霉素混合,最终浓度为每毫升25微克。旋转管,以确保在整个介质中均匀分布添加的部件。慢慢地,为了避免气泡形成,将20至25毫升约45摄氏度的培养介质倒入每个板中。如果出现气泡或泡沫,请使用常规移液器和无菌尖端快速清除。然后,立即更换所有盖子以防止污染。让琼脂在室温下凝固至少两小时或过夜。凝固后,将培养板倒置在四摄氏度,以尽量减少介质表面的冷凝。

要条纹文化选择,首先采取一个干净的文化板,并删除盖子。快速工作,将一次性无菌循环浸入所需的接种中,然后立即使用锯齿形运动将环拭过板的第一象限。更换盘子的盖子,丢弃用过的接种回路,然后选择一个新的无菌循环。使用新的循环,使三到四个笔画跨越从第一象限辐射的原始拭子线,该象限应包含相对密集的细菌群进入第二象限。再次关闭盖子,并丢弃循环。使用新循环时,再次重复此操作,但这次从第二个象限进入第三个象限。然后,再次使用新的循环,从第三段进入第四节。最后,使用新的循环,以锯齿形图案从第四象限向板中心进行最后一个描边。这一地区的细菌患病率将较低,理想情况下允许从单个活的母细胞建立单个菌落。

更换板盖,如果适合细菌种类,用底片密封板,以防止气流。将培养板倒置,以防止冷凝滴,然后放置在适当的温度进行生长。在这里,一个孵化器被设置为37摄氏度。让板孵育,直到细菌菌落可见。要生成克隆细菌群,请从该板块中选择一个离散菌群。现在,用无菌循环,触摸目标菌落,和以前一样,在新板的第一象限中发出条纹。继续交替消毒循环,并条纹板的剩余象限,如前所述,以锯齿形到中心结束。关闭板,并将其放置以孵育,直到离散菌落形成。一旦这些菌落生长,它们通常代表纯克隆菌株。

初始条纹板可能含有来自不同细菌物种的细胞或具有不同遗传成分的细胞的菌落,具体取决于样品纯度。通过随后分离单个菌落,其中所有单位都派生自一个共同的母细胞,第二条纹程序产生相对克隆的细菌群,适合进一步表征或接种到肉汤。

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

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