制限酵素処理

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

制限酵素、又はエンドヌクレアーゼは特定配列を認識しDNAを切断します。本来この酵素はバクテリオファージ(バクテリアに感染するウイルス)に対する防御機構としてバクテリアが作り出すものです。バクテリアの制限酵素は侵入したバクテリオファージのDNAを切断します。しかしバクテリア自身のゲノムDNAはメチル基が付加されているため制限酵素により認識されません。

このビデオでは、まず制限酵素の基本原理: 制限酵素の名前の由来、認識部位のタイプ、について説明しています。また、制限酵素処理のセットアップ方法、反応混合液の調製方法、一般的なインキュベーション温度や時間などの一般的手法を段階的に紹介しています。その中で、スター活性を防止するための制限酵素不活性化の必要性に触れ、さらに複数の制限酵素を用いた処理法やコントロール使用などのヒントも紹介しています。

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JoVE Science Education Database. 細胞生物学・分子生物学の実験法の基礎. 制限酵素処理. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

制限酵素、別名制限エンドヌクレアーゼは、様々な分子生物学の実験に利用されています。この種の酵素は、制限酵素部位と呼ばれるDNA配列を特異的に認識し切断します。 このビデオでは、この素晴らしいテクニックについての基本的な知識と制限酵素処理のセットアップ方法を紹介していきます。

一体制限酵素はどこからやってきたのでしょうか?この酵素は、バクテリオファージというウイルスに対する防御機構としてバクテリア自身が作り出すものです。バクテリアDNAの制限酵素部位にはメチル基が付加されており、制限酵素はファージDNAのみを認識し切断します。このようにしてバクテリアは感染を制御しているのです。

制限酵素には風変わりな名前がつけられています。例えば、HindIII、NotI、EcoRI、BamHIなどがあります。名前の最初の3文字で由来生物を示します。この制限酵素EcoRIは大腸菌から単離されたものであることが分かります。必要に応じて4番目の文字にその菌株名を入れます。最後のローマ数字でその特定の生物から分離された何番目の酵素であるのか、1番目なのか、2番目、3番目なのかということを知ることができます。

制限酵素処理は入念な計画が必要となります。一般的な制限酵素反応には、脱イオン水、切断するDNA、使用する酵素に特異的なバッファー、それから必要ならばBSAが用いられます。BSAは酵素処理を行う際に酵素が容器の側面に付着するのを防ぎ、反応の安定化を図るために利用されます。制限酵素はバッファーの条件、インキュベーション温度、BSAの有無などがそれぞれ異なります。これら必要な情報は制限酵素の販売元から提供されているのでその都度確認することができます。

制限酵素処理は、まず冷凍庫もしくは冷蔵庫から制限酵素を取り出すところから始まります。最適活性を保つために制限酵素は氷の上又は耐熱性の容器に置いておきます。各試薬をマイクロチューブに以下の順で加えます。まず最終反応液が20μLになるよう滅菌済みヌクレアーゼフリーの水。次に制限酵素の10xバッファー、それから必要ならばBSA、1μg以下のDNA、それに対し2から10ユニットの酵素を加えます。ユニットとはコントロールDNA1μgを、1時間、37°C、酵素反応液50μL中で完全に分解する酵素量のことです。ボルテックスで混合後、12000 xgで短時間の遠心を行い、チューブの底の混合液を回収します。そして制限酵素の最適温度、通常はヒーティングブロック上37℃で、1時間から4時間インキュベートします。

反応終了後、65°Cで加熱し酵素を不活性化します。制限酵素が特異的な切断を行っている最中のインキュベーション時間が長くなると、スター活性が生じる可能性があります。これは、典型的な認識部位とは同一でなく類似した配列を切断してしますことです。

インキュベーションに続き、完全に処理されているか確認するためにアガロースゲル電気泳動を行います。

ここで制限酵素処理を成功させるためのヒントをいくつかお伝えします。

実験を進める中で特異的なDNA断片を得るために複数の酵素が必要になるかもしれません。その場合は二つの酵素のバッファー条件とインキュベーション温度を確認します。もし一致すれば同じ反応液中で同時に切断可能です。しかしながら、もし二つの制限酵素で条件が異なる場合は、別々に酵素処理を行う必要があります。まずは、一つ目の酵素を用いて切断を行った後、二つ目の酵素に最適なバッファーに変更するという方法があります。もう一つ、バッファー条件の不適合を打開し連続して酵素処理を行うために、最初の酵素処理を行った後にDNAを精製し、それから二回目の酵素処理を行う方法があります。

処理がうまくいかないときの問題解決にはコントロールの使用が有用です。例えば、酵素を含まないコントロールを用いることで、DNAサンプルの状態とエキソヌクレアーゼ活性の有無を確認できます。また、既知の認識部位をもつコントロールDNAを使用することで酵素活性を確認できます。

ここまで酵素処理の方法を学んできました。ここからは制限酵素を使った様々な応用例を見ていきましょう。

制限酵素は診断にも応用でき、サンプルの検査に利用されます。特別なチップにDNA断片をロードし、バイオアナライザで分析します。ここでは魚サンプルの酵素処理によって生じたDNA断片の長さを分析し、その信頼性を確認しています。同一遺伝子を同様に酵素処理したにもかかわらず、バンドのパターンが異なることを制限酵素断片長多型と呼びます。

さらに制限酵素はサブクローニングにも用いられます。処理後のDNA断片を他のベクターに挿入し、バクテリアを利用して目的の断片を複製することが可能になります。

ポリメラーゼ連鎖反応すなわち PCRにより、制限酵素部位を遺伝子の特定の場所に導入することができ、制限酵素を用いて、同一遺伝子内での多型すなわち対立遺伝子での単一ヌクレオチドの違いを確認することができます。これら一塩基多型、SNPsはPCRや電気泳動だけでは検出に困難を極めます。SNP内に制限酵素部位を導入することで、酵素処理により簡単に対立遺伝子との識別が可能になります。

ここまでJoVE制限酵素編をご覧いただきました。制限酵素の由来、役割についての基本的な知識、酵素処理のセットアップ方法、そして最後に制限酵素の分子生物学への応用例を紹介しました。ご覧いただきありがとうございました。

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