Electrofisiología de patch Clamp

Neuroscience

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Summary

Las membranas celulares de la neurona se rellenan con canales iónicos que controlan el movimiento de carga dentro y fuera de la célula, de tal modo regulación de disparo de la neurona. Una técnica muy útil para la investigación de las propiedades biofísicas de estos canales se llama grabación de patch clamp. En este método, los neurólogos colocan una micropipeta de vidrio pulido contra una célula y succione para formar un sello de alta resistencia. Este proceso aísla un pequeño "parche" de la membrana que contiene uno o más canales de iones. Utilizando un electrodo dentro de la micropipeta, investigadores pueden "sujetar" o controlar las propiedades eléctricas de la membrana, que es importante para el análisis de la actividad del canal. El electrodo también permite cambios en el voltaje a través de la membrana, o el flujo de iones a través de la membrana, a grabar.

Este video comienza con un resumen de los principios de electrofisiología de patch clamp, una introducción a los equipos necesarios, y las descripciones de las distintas configuraciones de parche, como toda célula, célula Unido, perforado, dentro-fuera, y parches de salida exterior. A continuación, la tecla se describen los pasos de un experimento de abrazadera parche típico de células completas, en el cual se genera una curva de corriente / tensión (IV). Finalmente, aplicaciones de grabación de abrazadera del remiendo se proporcionan para demostrar cómo se evalúan las propiedades biofísicas de los canales iónicos y excitabilidad de la célula compuestos neuroactivos en los laboratorios de Neurofisiología hoy.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la Neurociencia. Electrofisiología de patch Clamp. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Grabación de abrazadera del remiendo es una técnica muy útil para la investigación de las propiedades biofísicas de los canales iónicos que controlan la activación neuronal.

El procedimiento consiste en presionar una micropipeta de vidrio contra una célula con el fin de aislar a un pequeño "parche" de la membrana que contiene uno o más canales de iones.

La disposición experimental adicional permite a los científicos para "fijar" el ambiente eléctrico de la zona parcheada controlando exactamente el voltaje a través de la membrana celular, que, dependiendo de los canales de iones presentes, afecta el flujo de iones a través de la membrana y permiten estudio intrincado de estos canales.

Este video presenta un resumen de los principios de la técnica de patch clamp, una descripción de los pasos necesarios para ejecutar un experimento y finalmente algunas de las aplicaciones de este método.

En primer lugar, revisemos los principios de la grabación de patch clamp.

El número de iones de cargados negativa y positivos dentro de una neurona difiere del número que se encuentra en el exterior.

Este desequilibrio produce una diferencia de voltaje o potencial de membrana de unos -70 mV, lo que significa que el interior es más negativo que el exterior.

Canales iónicos ayudan a mantener el gradiente por controlar el movimiento de iones a través de la membrana celular, que son esencialmente las corrientes eléctricas.

Usando la técnica de patch clamp, científicos preguntas acerca de la naturaleza del potencial y actual.

La plataforma de sujeción parche incluye una micropipeta de vidrio, que contiene una solución iónica y un electrodo de plata clorado para medirlas voltajes y corrientes.

La punta de la micropipeta tiene una abertura de un micrón pulido, que encierra un área pequeña de la membrana.

Para eliminar el ruido de fondo de los iones en la solución del baño, se forma un sello de alta resistencia entre el parche de la pipeta y la membrana. Porque la resistencia del sello está en la gama gigaohm, se conoce como sello gigaohm.

El electrodo dentro de la pipeta está conectado a un amplificador que puede amplifica las fluctuaciones de corriente y tensión que son el resultado del movimiento de iones a través de canales en la membrana plasmática.

Con el amplificador, los científicos pueden abrazadera o instalado artificialmente la membrana potenciales tensiones específicas.

El amplificador regula cuanta corriente debe añadirse mediante el electrodo de plata para mantener el voltaje constante.

Puesto que los canales iónicos de voltaje diferente abren tensiones específicas, eventos de apertura están representados por las variaciones en los perfiles de las corrientes measured¬.

Alternativamente, los científicos pueden forzar una corriente específica a través del electrodo y grabar los cambios resultantes en el potencial. En esta "pinza" se pueden registrar potenciales de acción de configuración.

Analicemos ahora los cinco principales tipos de configuraciones de patch clamp.

Primero es la configuración de conexión de celular donde la micropipeta se sella simplemente con la membrana de una célula intacta.

En segundo lugar es la configuración de célula entera donde se rompe la membrana dentro de la micropipeta para proporcionar acceso a la celda del interior.

En tercer lugar es la configuración de parche perforado. Aquí, productos químicos como los antibióticos se añaden a la micropipeta para hacer pequeños agujeros en la membrana de acceso al citosol.

La configuración del cuarto es el parche de adentro hacia afuera. Para lograr esto, la micropipeta forma un sello con la célula primero es retirada rápidamente, estafando a un pedazo de la membrana y exponer el interior de la superficie a la solución de baño.

Esto permite el lado citoplasmático de los canales de estar expuestos a diferentes productos químicos aplicados a la bañera.

Por último, similar al revés, el parche exterior-out comienza como una configuración de células completas. La micropipeta se retira lentamente hasta un trozo de membrana forma un sello convexo a través de la punta.

En esta configuración, la cara extracelular de la canal puede estar expuesta a tratamientos experimentales.

Ahora que hemos repasado los principios, vamos a ir sobre los pasos necesarios realizan una grabación de abrazadera del remiendo.

Empezar tirando de un tubo de vidrio borosilicato en Micropipetas utilizando un extractor de la pipeta.

A continuación, fuego Polaco la punta para obtener la resistencia y diámetro apropiado.

Después de pulir, llene la micropipeta con una solución iónica y flick suavemente para desalojar las burbujas de aire.

Luego deslice la micropipeta sobre el electrodo unido a un soporte.

Una vez conectado, utilice una jeringa para aplicar presión positiva a la pipeta, que impide la entrada de la punta de otras soluciones.

Ahora, coloque su células o tejido de interés en la platina del microscopio y hacia una celda de la micropipeta.

Con el amplificador genera pulsos de voltaje de prueba, registrar la resistencia, que se incrementará una vez que la punta esté en contacto con la célula.

Para formar el sello gigaohm, suavemente cambia de positivo a presión negativa con la jeringa. La formación de la Junta dará lugar a un rápido incremento en la resistencia a más de 1 giga ohm.

Ahora que se ha establecido una configuración celular conectado, vamos a convertir en una configuración de células enteras y hacer un experimento!

Hay que recordar que una configuración de conjunto de células es cuando se rompe la membrana.

Ruptura se logra mediante la adición de presión negativa para la micropipeta.

Una vez las roturas de la membrana, la forma de pulso de prueba tendrá grandes oscilaciones actuales, como la membrana de la célula ahora actúa como un condensador, que es cargado por el pulso de la prueba.

Las propiedades de un tipo de canal de iones individuales en cualquier neurona dada pueden ser investigadas bloqueando farmacológicamente la actividad de otros tipos de canales.

Un protocolo de paso de voltaje se utiliza para examinar las corrientes de canal del ion evocadas por el escalonamiento de la tensión a una serie de potenciales de explotación diferentes.

La corriente-voltaje o IV curva muestra las dependencias de voltaje de corriente que fluye a través de un ion del canal y proporciona una idea de a que voltajes el canal está abierto o cerrado.

Ahora veamos algunas aplicaciones para explorar lo que los neurólogos pueden hacer con esta técnica.

A veces, canales del ion encontrados neuronas pueden estudiarse en un entorno no celular.

Aquí los científicos han añadido proteínas de canal del ion a una membrana lipídica artificial para estudiar los canales de forma aislada.

Estos canales entonces pueden estar expuestos a las moléculas experimentales, como derivados del ají picante capsaicina, para estudiar su impacto en la actividad del canal.

Debido a que están expuestos al ambiente extracelular y un impacto significativo en la función celular, canales del ion hacen dianas farmacológicas excelente. Cuando los compuestos de prueba se agregan a las soluciones de micropipeta o baño, grabaciones de abrazadera del remiendo pueden utilizarse para probar directamente el efecto de drogas, como la nicotina, en actividad de los nervios. Incluso se ha aplicado el principio de la aplicación de presión negativa para formar un sello de alta resistencia para la construcción de dispositivos de alto rendimiento, que pueden grabar de numerosas células simultáneamente para aplicaciones de detección de drogas.

Abrazadera del remiendo de celulares es una herramienta valiosa para medir la respuesta de las células a los estímulos.

Además, grabaciones de pares pueden utilizarse para investigar el impacto de la neurona disparar sobre las células diana excitable, como el músculo. En este ejemplo, abrazadera del remiendo de la célula entera se utiliza para estimular el disparo de una neurona motora, mientras que las grabaciones son tomadas simultáneamente de la fibra del músculo que controla. Se observan relaciones claras entre la excitación neuronal y actividad muscular.

Sólo ha visto introducción de Zeus a parche abrazadera de grabación donde se revisaron los principios detrás de la técnica y pasos en marcha un experimento.

Con su exquisita sensibilidad temporal a los cambios de voltaje y corrientes, grabación de abrazadera del remiendo seguirá siendo fundamental en la comprensión de la biofísica de canales y las neuronas.

¡Gracias por ver!

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