SNP Genotyping

Genetics

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Summary

Polimorfismos de nucleótido único, o SNP, es la forma más común de variación genética en los seres humanos. Estas diferencias en bases individuales en el ADN a menudo no afectan directamente la expresión del gen, pero en muchos casos todavía pueden ser útiles para la localización de genes asociados a la enfermedad o para el diagnóstico de los pacientes. Se han establecido numerosas metodologías para identificar, o "genotipo", SNP.

Introducción de Zeus a SNP Genotyping comienza discutiendo son qué SNPs y cómo pueden ser utilizados para identificar genes asociados a la enfermedad. Luego se examinan varios métodos de genotipificación SNP comunes, incluyendo hibridación directo, métodos basados en PCR, análisis del fragmento y la secuencia. Por último, presentamos varios ejemplos de cómo se aplican estas técnicas a la investigación genética hoy en día.

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JoVE Science Education Database. Fundamentos de la genética. SNP Genotyping. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Variación genética se produce tanto dentro como entre poblaciones diferentes, y contribuye a la variación en rasgos, incluyendo la susceptibilidad de la enfermedad, entre los individuos. Las variaciones más comunes son polimorfismos de un solo nucleótido, o SNPs. SNP genotyping implica determinar los conjuntos específicos de variantes, en este caso SNPs presentes en un individuo.

Este video se discuten algunos de los principios detrás de genotipado SNP, dar una introducción a varios métodos comunes de identificación de SNP y finalmente, algunas aplicaciones de estas técnicas.

En primer lugar, vamos a discutir lo que es de un SNP y cómo puede utilizarse en genotipificación.

"Polimorfismos" son alelos o variantes de un locus genético, en una frecuencia apreciable dentro de una población e incluyen sustituciones de base así como las inserciones o eliminaciones. Polimorfismos de nucleótido único son las variaciones en una sola base de ADN. SNPs pueden ocurrir a lo largo de todo el genoma, y la mayoría no altere la expresión estructura o gen de la proteína. Sin embargo, todavía pueden asociados con enfermedades debido a su proximidad física, o "acoplamiento" a una variante genética que causa la enfermedad. Por otro lado, hay varios SNPs prominente que directamente causan enfermedades como la fibrosis quística, anemia de células falciformes y talasemia β.

Una aplicación práctica para el genotipado SNP es la medicina personalizada, donde la identificación de SNPs asociados con enfermedades, o con diferencial respuesta a un medicamento o terapia, puede ayudar a los médicos a diagnosticar y tratar a los pacientes mejor.

SNP también es útil para estudios de asociación del genoma, que examinan cientos de miles de SNPs en el genoma completo para identificarlas que están relacionadas con rasgos o enfermedades. GWAS aprovecha de grupos de SNPs conocidos como "haplotipos". SNPs dentro de un haplotipo son en "ligamiento," que significa que la particular combinación de variantes son más probables ocurrir juntos de lo esperado por azar, a menudo el resultado de su proximidad física en un cromosoma. Esto significa que se pueden distinguir haplotipos por genotipificación sólo un pequeño número de SNP individual, haciendo que la Asociación genética estudia menos costo - o mano de obra intensiva.

Después de mirar son qué SNPs y cómo pueden ser utilizados, vamos a ir a través de varias de las numerosas metodologías que han sido desarrolladas para genotipo SNPs. Estos incluyen hibridación directo, métodos basados en PCR, análisis del fragmento y la secuencia.

Técnicas de hibridación directa como SNP matrices utilizan sondas de oligonucleótidos cortos para identificar SNPs individuales directamente. Cientos de miles de SNPs pueden ser probados en un biochip sola. Las sondas se fijan químicamente a la matriz de chip, por lo general un portaobjetos de vidrio. Para la detección de SNPs en una muestra, ADN genómico aislado es amplificado por PCR y fragmentado para mejorar la eficacia vinculante de sonda. La DNA entonces se etiqueta, típicamente con un marcador fluorescente, seguido por el hibridación al chip. Después de que el ADN de la muestra se permite enlazar a las sondas, todo independiente o no específicamente ADN es arrastrado. Mediante la medición de la señal en cada punto de sondeo, puede determinarse la presencia del alelo blanco en la muestra.

Otro método de escribir SNP es PCR alelo-específica, donde cartillas están diseñadas contra secuencias que contienen el SNP para que ellos sólo hibridan al alelo perfectamente complementario. Los productos PCR pueden detectarse por métodos tales como etiquetas fluorescentes. Alternativamente, pueden diseñarse cebadores PCR que flanquean lo sitio SNP de interés junto con una sonda específica de SNP, como en el ensayo TaqMan PCR. Aquí, la sonda contiene un marcador fluorescente, así como una molécula de extintor que suprime la fluorescencia del marcador cercano. Durante la PCR, se degradará solamente la secuencia de la sonda específicamente por la actividad exonucleasa de 5′ de la polimerasa, separa la etiqueta fluorescente el quencher y dando por resultado una señal fluorescente que indica la presencia de la variante particular.

Una tercera categoría de métodos, llamados análisis del fragmento, implica la creación de fragmentos de ADN de diferentes tamaños o etiquetas, basadas en la presencia o ausencia de un determinado SNP. Análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción toma ventaja de la especificidad estricta de endonucleasas de restricción para sus secuencias diana, donde un alelo es hendido y el otro no. La ligadura emplea dos puntas de prueba situados directamente al lado de uno, uno de los cuales termina en el destino SNP basepair. Si la sonda que contiene el SNP se une perfectamente, puede ocurrir la ligadura. Ensayo de extensión de la cartilla implica cebadores que se unen un nucleótido por debajo del objetivo SNP. Esta cartilla entonces se extiende de variable basado en el alelo individual presentes. Los fragmentos generados por estos métodos se pueden distinguir entonces utiliza gel o electroforesis capilar o espectrometría de masas.

Finalmente, la secuencia puede detectar SNPs muy específicamente, así como identificar novela SNPs con secuencias desconocidas. Sin embargo, mucho cuidado y repeticiones experimentales adicionales deberán realizarse para distinguir SNPs reales de secuencias de errores de lectura. Como tecnologías de secuenciación más barata y más accesible, los investigadores están utilizando cada vez más secuencia de genotipificación.

Después de haber visto cómo el SNP puede ser genotipado, vamos a ver algunas aplicaciones específicas para estas técnicas.

Genotipado puede utilizarse para distinguir entre variedades de una especie con aspecto casi idéntico. Esto se logra por primer aislamiento de ADN genómico, seguido por PCR utilizando cebadores diseñados para enlazar secuencias de SNPs conocidos u otras variantes genéticas. Estos iniciadores sólo amplificará el ADN de la variedad que contiene el polimorfismo específico y así se pueden utilizar para distinguir entre estos parecidos.

Los investigadores también utilizan genotyping para identificar las bacterias patógenas que las mutaciones de resistencia a los fármacos específicos. Se establece un protocolo de matriz SNP optimizado para entornos de bajos recursos mediante la adición de genomic DNA y PCR master mix directamente a un chip. Hibridación y amplificación de la muestra se presentan en un solo paso. Los arreglos de discos entonces se lavan, reflejada, y resultados se analizan para determinar la presencia o ausencia de bacterias de la tuberculosis, así como cualquier mutaciones resistentes a los medicamentos.

Finalmente, el SNP puede utilizarse para evaluar la función de encontrar para aumentar el riesgo de enfermedad por estudios de Asociación de variantes genéticas. Aquí, los científicos experimentaron con una línea celular que es heterozigótica para un neutral "marcador" SNP ubicado en la parte transcrita de un gen de interés, así como una prueba untranscribed SNP que está asociada a la enfermedad. Una línea de células de control negativo es elegida que es heterozigótico para el marcador SNP, pero homocigotos para la variante asociada enfermedad no de la prueba del SNP. Extensión primer alelo-específica fue realizada en la DNA genomic, así como inversa del cDNA transcrito de mRNA expresado. Los productos de extensión de la cartilla luego fueron cuantificados mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Al comparar la abundancia relativa de los fragmentos asociado con los alelos de dos marcadores SNP, los investigadores pueden determinar si el SNP asociados a la enfermedad resulta en la expresión génica reducida.

Sólo has visto video de Zeus en el genotipado SNP. Este video presenta el concepto y usos de SNPs, varios métodos básicos para identificar y caracterizar SNPs y destacó tres aplicaciones de genotipado SNP. ¡Como siempre, gracias por ver!

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