染色质免疫沉淀

Genetics

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Summary

组蛋白是蛋白质,帮助组织 DNA 在真核细胞核中充当"脚手架"围绕的 DNA 可以包裹,形成一个复杂,被称为"染色"。这些蛋白质可以修改通过加入适量的化学基团,并且这些更改影响基因表达。研究人员使用一种叫做染色质免疫沉淀 (芯片) 技术来更好地理解关联特定组蛋白修饰或其他的基因调控蛋白的 DNA 区域。抗体用于分离蛋白质的兴趣,并绑定的 DNA 提取用于分析。

在这里,朱庇特提出了芯片,背后的原则讨论特定组蛋白修饰与基因表达和 DNA 组织及其关系。然后,我们审查如何执行协议芯片,并探索科学家们目前正在使用这种技术的方式。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 遗传学精要. 染色质免疫沉淀. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

染色质免疫沉淀或"芯片"是一种技术研究者用于评估蛋白-DNA 相互作用。蛋白因子在基因调控; 发挥重要作用不只做他们组织 DNA 在染色体,但他们也将绑定到特定的 DNA 序列 — — 称为监管网站 — — 来激活或抑制表达。在芯片,染色质 — — 包括 DNA 和其相关联的蛋白质 — — 是"修剪",意思它孤立的使用抗体。使用此方法,研究者们可以评估哪些蛋白质与 DNA 序列相关联。

在这个视频中,我们会检讨染色质修饰和他们的角色在表观遗传调控和如何芯片可以化验这些修改。我们将接着描述了这种技术,广义的过程和最后讨论科学家如今怎样使用芯片的研究。

让我们首先回顾染色质修饰是什么,以及如何与芯片研究它们。

在真核生物,DNA 存储在细胞核中被"缠"蛋白复合物。这些蛋白质是组蛋白,和每个项复杂 DNA 包裹的组蛋白被称为"核小体"。基因表达调控的"核小体的入住率"或是否一片 DNA 包装成核小体。转录的 DNA 往往位于"核小体免费"的地区,允许将基因调控位点,与相关联的蛋白质,使 RNA 聚合酶进行转录。

目前的证据表明染色质结构的变化,调节基因的表达介导化学修饰对组蛋白,通常在他们自由移动的"尾巴"。其中最常用的是乙酰基、 甲基和磷酸基团已被添加或移除从特定氨基酸,和观察,这些不同的组蛋白修饰与不同级别或基因表达模式相关联。

例如,另外 3 个甲基基团对 27 赖氨酸残留在组蛋白亚基 H3 — — 修改称为 H3K27me3 — — 挂钩基因沉默。另外,H3K9ac 修改,在那里乙酰基组添加到的组蛋白 H3 第 9 的赖氨酸残基,已与基因活化有关。

据推断,组蛋白修饰在基因表达的表观遗传调控中发挥作用,通过标记区域的染色质为"活动"或"沉默"。哪组蛋白通过修改被认为发挥作用的机制之一是,聘请转录因子或染色质"重塑"酶,后者身体移动的核小体位置。

芯片,与特定的组蛋白修饰可以有针对性的抗体,可以被"推倒"及 DNA 的周围。研究者可以然后运用 PCR 微阵列,或测序识别 DNA 区域与组蛋白修饰的兴趣。通过改变在芯片过程中使用的抗体,这种技术还可以帮助查明受转录因子和其他调节蛋白的 DNA 区域。

现在,你知道背后芯片的原则,通过这种技术的广义过程吧。

若要开始,感兴趣的细胞是收集并处理与化学物质如甲醛,充当"交联"试剂并帮助贴上他们将通过促进它们之间的共价键的形成与相关联的 DNA 序列的蛋白质。必须小心不"过度治疗"的单元格与甲醛,因为这会影响的抗体芯片后期识别其目标组蛋白修饰的能力。若要停止交联过程,甘氨酸被添加到细胞正受到甲醛溶液。细胞然后收集并裂解释放染色质。

染色质溶解,并精确地定义关联组蛋白修饰的 DNA 区域,染色质机械地"剪"成小块,利用声波 — — 这个过程被称为超声波。通常情况下,科学家旨在创造染色质碎片 200 至 1000年个碱基对的长度。一旦所需大小的染色质碎片时,会产生一种抗体添加到解决方案中,和混合培养,给抗体时间认识到其目标组蛋白修饰。

磁珠的抗体可以绑定然后引入的混合物,固定化抗体相关的染色质配合物。珠被收集利用磁架,并洗了几次,以冲洗掉任何绑定染色质或抗体。

要释放从他们染色质,在含 SDS,洗涤剂溶液中放置珠和收集后用磁铁珠上, 清液保持。酶蛋白酶 K 然后添加到此解决方案将所有的蛋白质,包括组蛋白,所以,染色质 DNA 组件可以是孤立降解。由此产生的 DNA 是净化,然后分析了。

让我们现在看看如何科学家目前芯片在使用他们的实验室。

许多研究者使用芯片来评估组蛋白修饰胞外信号所带来的变化。在这里,人类细胞受到与一个特定的细胞因子或信号分子,而组蛋白甲基化变化进行评估。通过测定与实时荧光 PCR 芯片 DNA,研究人员确定,— — 在对治疗的反应 — — 转录因子编码基因IRF1获得活化的组蛋白标记,H3K36me3。这一修改使调节蛋白和 RNA 聚合酶 II 与IRF1,导致其转录相关联。

芯片也可以用来深入了解基因表达在组织损伤和再生过程中发生的变化。在这个实验中,研究人员破坏小鼠周围神经系统的一个组成部分 — — 坐骨神经 — — 然后用芯片寻找新型 DNA-蛋白质相互作用在其他周围神经系统结构中,像侧脊髓神经节。科学家认为,神经损伤后,p53 蛋白,是调节 DNA 修复,成为了关联,与牵连GAP43组织再生的基因。

最后,一些科学家正努力精简芯片程序,以提高吞吐量和实验的效率。在这里,研究者们能够"自动化"芯片,有一台机器,在议定书 》 中执行多个步骤。这允许研究者同时评估相关与几个不同的组蛋白修饰,使用相对较小数量的细胞的 DNA — — 10,000 — — 所见与较大的单元格编号,或标准,《 手册 》 的芯片技术相似的成果。

你刚看了染色质免疫沉淀的朱庇特的视频。在这个视频中,我们讨论了如何 DNA 和蛋白质一起形成染色质和一项议定书,步骤称为芯片,可用于标识相关与特定染色质国家或蛋白质的 DNA 序列。我们还探讨了研究人员是如何使用和修改芯片在基因调控过程中更好地理解 DNA-蛋白质间相互作用的影响。一如既往,感谢您收看 !

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