クロマチン免疫沈降

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Advanced Biology collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

ヒストンは、蛋白質を DNA が「クロマチン」と呼ばれる複合体を形成、ラップすることができます「足場」として、真核生物の核内 DNA を整理しますしますできます。これらの蛋白質は化学グループを追加で変更できます、これらの変更に影響を与える遺伝子発現。研究者は、特定のヒストン修飾または他の遺伝子調節タンパク質に関連付ける DNA 領域を理解するのにクロマチン免疫沈降 (チップ) と呼ばれる技術を使用します。抗体は興味の蛋白質を分離する使用され、バインドされた DNA を抽出し、分析。

ここで、ゼウスは特定のヒストンと DNA 組織の遺伝子発現との関係を議論するチップは、背後にある原理をプレゼントします。その後、科学者は、現在この技術を使用している方法を調べて、チップ プロトコルを実行する方法を確認します。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 遺伝学の必需品. クロマチン免疫沈降. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

クロマチン免疫沈降、または「チップ」には、蛋白質 DNA の相互作用を評価するために研究者によって使用される手法です。蛋白質の要因の遺伝子発現制御に重要な役割を再生します。彼らは染色体、DNA を整理を行うだけでなく、彼らはまた特定の DNA シーケンスにバインド-規制サイトと呼ばれる-式を抑制または非アクティブにします。チップの中にクロマチン-DNA およびその関連付けられている蛋白質から成っている-」において、「抗体を使用して孤立したことを意味は、。この方法では、研究者はどの蛋白質に関連付けるどの DNA シーケンスを評価できます。

このビデオではクロマチン修飾とエピジェネティック制御とどのようにチップは、これらの変更を分析することが自分の役割を確認します。この技術のための一般的な手順を説明します、最後に検討する方法の科学者を使用しているチップ研究の今日。

クロマチン修飾とチップでそれらを勉強方法の見直しから始めましょう。

真核生物の DNA は蛋白質の複合体のまわりに「包まれて」核に格納されます。これらのタンパク質は、ヒストン、各 DNA ラップ ヒストン複雑な「ヌクレオソーム」と呼ばれます「ヌクレオソームの占有率」的に遺伝子発現制御や DNA は、ヌクレオソームに詰め込まれてどうかのストレッチ。転写された DNA は、遺伝子の調節部位とを関連付ける蛋白質を許可し、転写を行う RNA ポリメラーゼを有効にする「ヌクレオソーム無料」地域に位置する傾向があります。

現在の証拠は、遺伝子発現を制御するクロマチン構造の変化は通常は自由に移動する「尾に「ヒストンへの化学修正によって仲介されることを示唆しています。これらの最も一般的なは、追加、または削除、特定のアミノ酸のリン酸基、メチル、アセチルとさまざまなレベルや遺伝子発現のモードに関連するこれらの異なるヒストン修飾が観察されます。

ヒストン H3 の 27 のリジン残基に 3 つのメチル グループの付加など-変更は、H3K27me3 を呼ばれる-遺伝子サイレンシングにリンクされています。また、アセチル基 9 ヒストン H3 リジン残基に追加する位置、H3K9ac 変更は、遺伝子の活性化に関連付けられています。

ヒストン修飾を仮説として「アクティブ」または「サイレント」クロマチンの領域をマークすることによって遺伝子発現のエピジェネティック制御の役割を果たすにどのヒストンによる変更がその効果を発揮すると考えられている 1 つのメカニズムは、転写因子やクロマチン酵素、後者の場合、物理的に移動ヌクレオソームの位置を「再構築」を募集することです。

チップは、特定のヒストンの修正はおろすことができる」「周囲の DNA と共に抗体の対象にできます。研究者は、PCR、マイクロ アレイを使用できます。 または DNA 領域を識別するシーケンスに関連付けるヒストン修飾の関心。チップの中に使用される抗体を変えることによって、この手法では正確な転写因子とその他の規制の蛋白質によってバインドされている DNA 領域こともできます。

チップの背後にある原理を理解するは、この技術のための一般的な手順を行ってみましょう。

まず、興味のセルは収集および試薬「クロスリンク」行動と彼らはそれら間結合形成を促進することによって関連付ける dna に蛋白質を貼付、ホルムアルデヒドなどの化学物質と扱われます。後期チップのヒストンの修正をそのターゲットを認識する抗体の能力に影響を与えることができますので、"治療"をセルではなく、ホルムアルデヒドとに注意する必要があります。架橋プロセスを停止するには、セルを扱われているホルムアルデヒド溶液にグリシンを追加します。セルは収集し、クロマチンを解放する分離します。

クロマチンを可溶化して正確に関連付ける変更されたヒストン DNA 領域を定義するには、クロマチン、機械的に「剪断」音波を使用してより小さな部分に、超音波処理と呼ばれるプロセスです。通常、科学者は、長さでクロマチン フラグメント 200 〜 1000 塩基対を作りを目指します。一度希望するサイズのクロマチン フラグメントが生成され、抗体がソリューションに追加され、そのターゲットのヒストン修飾を認識する抗体の時間を与える混合物を培養します。

抗体をバインドする磁気ビーズは、抗体関連するクロマチン複合体を固定、混合物に紹介します。ビーズは磁気ラックを使用して収集され、任意の非連結クロマチンや抗体を洗い流す数回洗浄され。

クロマチンからそれらを解放するビーズは、SDS、洗剤の溶液に配置され、上澄みを保持磁石でビーズを収集した後。酵素プロティナーゼ K は、クロマチン DNA コンポーネントを分離できるように、ヒストンを含むすべての蛋白質を低下させる、このソリューションに追加されます。結果として得られる DNA は精製し、分析します。

科学者は彼らのラボでチップを現在使用する方法を見てをみましょう。

多くの研究者は、細胞外のシグナルによってもたらされるヒストン修飾の変化を評価するのにチップを使用します。ここでは、特定のサイトカインやシグナル伝達分子とひと培養細胞が扱われ、ヒストンのメチル化の変化を評価しました。リアルタイム PCR が付いている DNA チップ試金の研究者を決定する-治療に応答 — 転写因子エンコーディング遺伝子IRF1を得て活性化ヒストン マーク、H3K36me3。この変更には、調節タンパク質と RNA ポリメラーゼ II IRF1、その転写結果に関連付けるの両方が有効になります。

チップは、組織の損傷と再生中に発生する遺伝子発現の変化への洞察力を得るためにも使用できます。この実験では、研究者はマウスの末梢神経系のコンポーネントを破損している-坐骨神経-フランクの脊髄神経節のような他の末梢神経系の構造における新規 DNA-タンパク質相互作用を探すためチップを使用し、。科学者は、次の神経損傷、DNA 修復のレギュレータである p53 タンパク質がGAP43組織再生に関与する遺伝子と準になったことと結論。

最後に、いくつかの科学者は、スループットと実験の効率を向上させるチップ手順の合理化に向けて取り組んでいます。ここでは、研究者は「自動化」チップ、マシンのプロトコルの手順の多くを実行することができます。これは比較的少数の細胞を使用して関連付けられているいくつかの異なるヒストン修飾 DNA を同時に評価するために研究者を許可-10,000、セル数、または標準的な「マニュアル」のチップ技術を見られるそれらに類似した結果をもたらします。

クロマチン免疫沈降でゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオでは、DNA とタンパク質一緒にフォーム クロマチンとプロトコルの手順がチップ特定クロマチン状態またはタンパク質に関連付けられた DNA シーケンスを識別するために呼び出されますを説明しました。研究者の使用や遺伝子の規則の間に DNA 蛋白質の相互作用の役割を理解するチップを変更するどのようにも調査しました。いつも見てくれてありがとう!

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE

Applications