Chromatin Immunopräzipitation

Genetics

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Summary

Histone sind Proteine, die DNA in eukaryotic Kernen durch das dienen als "Gerüste" um die DNA gewickelt werden kann, bilden einen Komplex namens "Chromatin" organisieren. Diese Proteine können durch die Zugabe von chemischen Gruppen geändert werden, und diese Änderungen beeinflussen Genexpression. Forscher verwenden eine Technik namens Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), um besser zu verstehen, welche DNA-Regionen spezifische Histon-Modifikationen oder andere gen regulatorische Proteinen zuzuordnen. Antikörper werden verwendet, um das Protein des Interesses zu isolieren, und die gebundene DNA ist für die Analyse extrahiert.

Jupiter stellt die Prinzipien hinter ChIP, spezifische Histon-Modifikationen und ihre Beziehung zur Genexpression und DNA-Organisation diskutieren. Wir überprüfen dann, wie Sie ein ChIP-Protokoll ausführen, und entdecken die Möglichkeiten, die Wissenschaftler derzeit diese Technik verwenden.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Genetik. Chromatin Immunopräzipitation. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Chromatin Immunopräzipitation oder "ChIP" ist eine Technik, die von Forschern verwendet, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu beurteilen. Protein-Faktoren spielen eine wichtige Rolle in der Genregulation; organisieren sie DNA in den Chromosomen, sondern sie auch binden an spezifische DNA-Sequenzen – regulatorische Websites genannt — zu aktivieren oder Ausdruck zu unterdrücken. Während der ChIP Chromatin – bestehend aus DNA und seine damit verbundenen Proteine – ist "Immunoprecipitated", was bedeutet, dass es durch den Einsatz von Antikörpern isoliert ist. Mit dieser Methode können Forscher beurteilen, welche Proteine welche DNA-Sequenzen zuordnen.

In diesem Video werden wir überprüfen Chromatin Modifikationen und ihre Rolle im epigenetischen Regulation und wie ChIP diese Änderungen überprüfen kann. Wir werden dann beschreiben ein allgemeines Verfahren für diese Technik und schließlich zu diskutieren, wie Wissenschaftler heute ChIP in der Forschung verwendet werden.

Lassen Sie uns zunächst was Chromatin Modifikationen sind und wie sie mit ChIP zu studieren.

In den Eukaryotes wird DNA in Kernen von um Proteinkomplexe "gewickelt" gespeichert. Diese Proteine sind Histone und jede DNA verpackt Histon komplexe nennt man eine "Nukleosom." Genexpression "Nukleosom Belegung" geregelt ist, oder ob eine Strecke von DNA in Nukleosomen gepackt ist. Transkribierte DNA neigt dazu, in "Nukleosom-freien" Regionen befinden, die Proteine, die ein Gen regulatorischen Websites zugeordnet, und ermöglichen RNA-Polymerase, Transkription durchzuführen.

Aktuelle Hinweise darauf, dass Änderungen in der Chromatinstruktur, die Genexpression regulieren durch chemische Änderungen an Histone, in der Regel in den frei beweglichen "Schwänzen" vermittelt werden Die häufigsten davon sind Acetyl, Methyl- und Phosphatgruppen, die hinzugefügt oder entfernt werden, bestimmte Aminosäuren, und diese verschiedenen Histon-Modifikationen sind auf verschiedenen Ebenen oder Modi der Genexpression zugeordnet werden beobachtet.

Beispielsweise die Zugabe von drei Methylgruppen an der 27. Lysin Rückstand in Histon-Untereinheit H3 – eine Modifikation bezeichnet H3K27me3 — zu Gen-silencing verknüpft wurde. Alternativ wurde die H3K9ac Änderung, wo der 9. Lysin Rückstand auf Histon H3 eine Acetyl-Gruppe hinzugefügt wird, Genaktivierung zugeordnet.

Histon-Modifikationen werden vermutet, um eine Rolle bei der epigenetischen Regulation der Genexpression durch Markieren Regionen von Chromatin als "aktiv" oder "Stille." Ein Mechanismus, durch welchen Histon Änderungen geglaubt werden, um ihre Wirkung ausüben, soll Transkriptionsfaktoren oder Chromatin "Umbau" Enzyme, von denen die letztere körperlich bewegen Sie die Positionen der Nukleosomen zu rekrutieren.

Mit ChIP können spezifische Histon-Modifikationen durch Antikörper, ausgerichtet sein, die "zusammen mit den umliegenden DNA niedergerissen werden können". Forscher können dann PCR, Microarrays, beschäftigen oder Sequenzierung, DNA-Regionen zu identifizieren assoziieren mit Histon-Modifikationen von Interesse. Durch Variation der Antikörper während der ChIP verwendet, hilft diese Technik auch DNA-Regionen von Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine gebunden zu lokalisieren.

Nun, da Sie die Prinzipien hinter ChIP wissen, gehen Sie wir durch eine generalisierte Verfahren für diese Technik.

Um zu beginnen, werden Zellen von Interesse gesammelt und behandelt mit Chemikalien wie Formaldehyd, die als "Vernetzung" Reagenzien fungieren und helfen, Proteine, DNA-Sequenzen anbringen, die sie zuordnen, indem die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen ihnen zu erleichtern. Nicht "über Leckerbissen" Zellen mit Formaldehyd, muss darauf geachtet werden, da dies die Fähigkeit von Antikörpern, ihre Ziel-Histon-Modifikationen in einem späteren Stadium der ChIP erkennen auswirken kann. Um die Vernetzung zu stoppen, Glycin die Formaldehyd-Lösung ergänzt, mit denen Zellen behandelt werden. Die Zellen werden dann gesammelt und lysiert um das Chromatin zu lösen.

Um anderweitig Chromatin und genau definieren, die DNA-Abschnitte, die geänderten Histone zuordnen, Chromatin ist mechanisch "geschert" in kleinere Stücke mit Schallwellen – einen Prozess namens Beschallung. Wissenschaftler wollen in der Regel Chromatin Fragmente 200 bis 1000 Basenpaare lang zu schaffen. Sobald Chromatin Fragmente der gewünschten Größe erzeugt werden, ein Antikörper wird der Projektmappe hinzugefügt, und die Mischung inkubiert wird, um die Antikörper-Zeit, deren Ziel-Histon-Änderung zu erkennen geben.

Magnetische Beads, an die die Antikörper binden können, werden dann in die Mischung, die Antikörper-assoziierten Chromatin komplexe Immobilisierung eingeführt. Die Perlen werden durch die Verwendung von magnetischen Gestelle gesammelt und mehrmals abwischen alle ungebundenen Chromatin oder Antikörper gewaschen.

Um das Chromatin daraus zu lösen, werden Perlen in einer Lösung, die das Waschmittel SDS, und nach dem Sammeln der Perlen mit einem Magneten, der Überstand wird gehalten. Das Enzym Proteinase K wird dann hinzugefügt, um diese Lösung zu erniedrigen alle Proteine, die Histone, darunter, so dass die DNA-Komponente des Chromatins isoliert werden kann. Die daraus resultierende DNA wird dann gereinigt und analysiert.

Werfen wir nun einen Blick auf wie Wissenschaftler derzeit ChIP in ihren Labors verwenden.

Viele Forscher verwenden ChIP, um Änderungen in Histon Änderungen herbeigeführt durch extrazelluläre Signale auswerten. Hier kultivierte menschlichen Zellen mit einem spezifischen Cytokine oder Signalmolekül behandelt wurden, und Änderungen in der Histon-Methylierung bewertet wurden. Durch DNA-ChIP mit Real-Time PCR prüfen, Forscher bestimmt, die – in Reaktion auf die Behandlung – die Transkription Faktor-Kodierung gen IRF1 gewann eine aktivierende Histon-Mark, H3K36me3. Diese Änderung ermöglicht eine regulatorische Proteine und RNA-Polymerase II, IRF1, wodurch die Transkription zugeordnet.

ChIP kann auch verwendet werden, Einblick in Veränderungen in der Genexpression, die auftreten, während Gewebeverletzungen und Regeneration. In diesem Experiment Forscher beschädigt eine Komponente des peripheren Nervensystems bei Mäusen – den Ischiasnerv — und dann ChIP verwendet, um neuartige DNA-Protein Interaktionen in anderen Strukturen des peripheren Nervensystems, wie die Ganglien zu suchen, die das Rückenmark zu flankieren. Wissenschaftler folgerten, dass folgende Nervenverletzung, das p53-Protein, das ein Regulator der DNA-Reparatur ist, verbunden mit einem Gen in die Regeneration des Gewebes, GAP43verwickelt wurde.

Zu guter Letzt arbeiten einige Wissenschaftler an der Straffung der ChIP Verfahren erhöhen den Durchsatz und die Effizienz der Experimente. Hier konnten die Forscher "ChIP, mit einer Maschine, die viele der Schritte in das Protokoll ausführen zu automatisieren". Dies konnten die Forscher DNA mit mehreren verschiedenen Histon Änderungen verbunden mit Hilfe eine relativ kleine Anzahl von Zellen gleichzeitig beurteilen – 10.000 — Ergebnisse ähnlich denen mit größeren Zellzahlen oder standard, "manuelle" ChIP-Techniken.

Sie haben nur Jupiters Video auf Chromatin Immunopräzipitation angesehen. In diesem Video haben wir besprochen, wie DNA und Proteine bilden zusammen Chromatin und die Schritte eines Protokolls, ChIP,, die verwendet werden können genannt, um DNA-Sequenzen, die verbunden sind mit bestimmten Chromatin Staaten oder Proteine zu identifizieren. Wir haben auch wie Forscher verwenden und ändern von ChIP, um besser zu verstehen, die Rolle der DNA-Protein Interaktionen während der Genregulation. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

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