Le test de Migration Transwell

Cell Biology
 

Summary

Migration de cellules en réponse à des signaux chimiques est cruciale pour les États de développement, l’immunité et les maladies comme le cancer. Afin de quantifier la migration cellulaire, un simple a été développé en 1961 par le Dr Stephen Boyden, qui est maintenant connu comme le test de migration transwell ou essai de chambre de Boyden. Ce set-up compose d’un encart qui sépare les puits d’une plaque multipuite dans les compartiments supérieurs et inférieurs. Les cellules dont la migration est à étudier sont ensemencés dans le compartiment supérieur, et la solution chimioattractant est placée dans le compartiment inférieur. Après incubation, compter les cellules dans le compartiment inférieur permet la quantification des migrations induites par chimioattractants.

Cette vidéo passera en revue le montage expérimental couramment utilisé pour les études sur la migration cellulaire. Puis nous allons mettre en évidence quelques considérations-clés et décrivent un protocole généralisé pour exécuter une expérience impliquant des cellules adhérentes. Enfin, nous allons examiner diverses variantes de cette configuration actuellement utilisé pour étudier les différents facteurs qui affectent la migration.

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JoVE Science Education Database. Notions essentielles de biologie cellulaire. Le test de Migration Transwell. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

L’essai de migration transwell est une technique classique qui permet aux scientifiques de quantifier le mouvement cellulaire. Migration se réfère à la capacité d’une cellule à déplacer individuellement ou en groupes. Mouvements cellulaires sont rendues possibles grâce à une restructuration précis de leur cytosquelette et la migration se produit habituellement en réponse à des stimuli qui agissent comme des signaux.

Aujourd'hui, nous allons discuter de l’analyse de migration transwell, qui utilise une configuration chambre simple pour évaluer la migration en réponse aux signaux de l’attirer.

Nous allons commencer par fournir des renseignements généraux sur la chambre transwell.

L’appareil a été conçu par le Dr Stephen Boyden en 1961, qui l’a utilisé pour étudier la migration des leucocytes. Par conséquent, cette méthode est également connu comme le test de chambre de Boyden.

Dans une simple chambre de Boyden, la paroi extérieure est des puits, comme ceux d’une plaque de 96 puits. À l’intérieur de chaque puits, un transwell, qui est un insert cylindrique, est placé. L’insert a une membrane en polycarbonate d’une taille de pore. Lorsqu’il est placé dans le puits, il divise la chambre en deux compartiments. Le compartiment supérieur est où seront attribués les cellules dont le comportement migrateur est à étudier, et le réservoir inférieur est où la solution de chimioattractant est placée. Par définition, un facteur chimiotactique est une molécule qui a la capacité de promouvoir la mobilité cellulaire en « attirant des cellules ».

En raison de ces forces d’attraction, les cellules dans le compartiment supérieur migrent à travers les pores dans le réservoir inférieur. Si les cellules ont des propriétés adhérentes, comme certaines cellules du mélanome, suivant le mouvement qu’ils seront « coller » à la face inférieure de la membrane. Dans ce cas, la membrane peut être fixe, colorées, et on peuvent compter des cellules au microscope. En revanche, les cellules non adhérentes, comme sperme, migrera dans le réservoir inférieur. Dans ce cas, on peuvent compter les cellules dans la solution du réservoir à l’aide d’un hémocytomètre.

Bien que la configuration pour ce test est simple, il y a plusieurs choses que vous devez considérer avant l’expérience. Passons en revue certains d'entre eux.

À partir de la solution de semis, il faut s’assurer que la masse volumique est optimisée afin d’observer la migration cellulaire. Trop peu de cellules peut entraîner la migration indétectable, et une plus grande densité va surpeupler la membrane, rendant difficile d’énumérer des migrations. La deuxième considération est la taille des pores de l’insert. Il doit être choisi avec soin selon le type de cellule. Si la taille des pores est trop petite, les cellules ne pourront pas passer.

Alternativement, si la taille des pores est trop grande, cellules tout tombera, qui n’est pas migration. Enfin, il faut être conscient de la concentration de facteur chimiotactique et le temps d’incubation est admis à la migration, car ils sont interdépendants. Concentration optimale avec des temps d’incubation appropriés pendant lequel le gradient de concentration est maintenue entre les compartiments, induit la migration cellulaire due à la chimio-attraction. À l’inverse, incubation prolongée peut être accompagnée d’une équilibration du facteur chimiotactique partout dans la chambre menant à la perte du gradient chimique, ce qui peut confondre l’analyse des résultats obtenus.

Avec ces considérations à l’esprit, nous allons discuter un protocole utilisé pour mesurer la migration des cellules adhérentes.

Cellules à doser sont préparées dans un milieu exempt de protéase, puisque les protéases peuvent dénaturer les récepteurs membranaires importantes et affectent en fin de compte les migrations. Lorsque les cellules sont terminés, la suspension doit être diluée à une densité de semis optimale. Afin de préparer la chambre, les transwells sont placés dans les puits sur une plaque multipuite. Suspension cellulaire devrait être distribuée dans le transwell sans toucher la membrane ou d’introduire des bulles d’air.

Solution chimioattractant est reversée dans le réservoir inférieur, en s’assurant que la solution touche la membrane de l’insert. Le temps d’incubation pour la migration dépend des considérations expérimentales. Après incubation, les membranes sont fixés en plongeant l’insert dans l’éthanol à 70 %. Après avoir laissé l’insert sécher, cellule solution de coloration est ajoutée.

Ensuite, les cellules sont incubées pendant environ 30 minutes à température ambiante. Après incubation, les inserts sont lavés à l’aide du tampon de lavage. Enfin, la membrane peut être excisée et placée sur une lame de microscope. Sur la face inférieure de la membrane des cellules représentent le nombre de cellules qui ont migré en présence et en absence de chimioattractants.

Depuis lors, maintenant vous avez une idée pour le protocole, nous allons jeter un bref regard sur comment les chercheurs utilisent cette méthode dans leurs explorations.

Une des applications plus courantes de ce test est d’évaluer le facteur chimiotactique des propriétés des composés inconnus. Ici, les scientifiques ont été intéressés par l’examen de natation chemins des spermes de grenouille en présence d’allurin, qui est une substance sécrétée par les oeufs d’amphibiens. Pour ce faire, ils ont tout d’abord éjectant spermatozoïdes grenouille active vers le haut des inserts transwell. Au fond, ils ont ajouté allurin. Après avoir laissé les cellules à migrer, ils ont compté sperme dans la solution du réservoir sous un microscope. En utilisant cette technique, ils étaient en mesure de générer une courbe concentration-réponse illustrant l’effet de la concentration allurin sur la migration des spermatozoïdes.

Quand une cellule est attaquée par des agents pathogènes, il envoie des chimioattractants recruter des cellules immunitaires qui migrent, fixer et régler par la suite une infection. Pour tester ce phénomène, ces scientifiques mis en culture des cellules épithéliales sur la face inférieure des inserts. Par la suite, ils ont infecté ces cellules avec différentes souches de bactéries. Enfin, ils ont introduit des cellules immunitaires dans la chambre supérieure. On sait que les cellules infectées produisent plusieurs chimioattractants qui induisent la migration des cellules immunitaires. Les résultats de cette expérience ont démontré différents degrés de migration neutrophile en réponse à différents types d’infections bactériennes.

Enfin, invasion des cellules du cancer et des métastases par le biais de la matrice extracellulaire a toujours intrigué les biologistes cellulaires. Ici, les scientifiques voulaient déterminer comment certains chimioattractants peuvent contribuer à ces migrations grâce à une matrice 3D. Ils ont modifié génétiquement deux catégories distinctes de cellules : une expression vert fluorescent et une autre protéine fluorescente, rouge. Ils ont ensuite éjectant un imitateur-matrice extracellulaire vers le haut de transwells.

Une fois solidifié, ils ont inversé le transwell et ensemencé deux pools de cellules sur le dessous de la membrane. Ensuite, ils ont remplacé l’insertion dans la plaque multipuite et distribuer la solution chemoattractant dans la chambre supérieure. Cela a provoqué les cellules en bas pour la déplacer vers le haut et par le biais de la matrice 3D. Avec l’aide de l’imagerie confocale, ces chercheurs ont reconstruit la migration cellulaire en 3D et distingue les schémas de migration de deux groupes de cellules.

Vous avez juste regardé la vidéo sur le test de migration transwell de JoVE. La compréhension des composantes et le protocole de cette méthode, vous savez maintenant pourquoi il est si largement utilisé par les biologistes cellulaires. Malgré la simplicité de cette configuration, l’éventail de configurations, que cette méthode peut adapter le rend indispensable pour les études de motilité cellulaire. Comme toujours, Merci pour regarder !

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