Électrophorèse bidimensionnelle

Biochemistry

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Summary

Électrophorèse bidimensionnelle (2DGE) est une technique qui peut résoudre des milliers de molécules d’un mélange. Cette technique implique deux méthodes distinctes de séparation qui ont été accouplés : isoélectrofocalisation (IEF) et sodium dodécyl sulfate sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). Ceci sépare physiquement composés à travers deux axes d’un gel de leurs points isoélectriques (une propriété électrochimique) et leurs poids moléculaires.

La procédure dans cette vidéo couvre les principaux concepts de 2DGE et une procédure générale pour caractériser la composition d’une solution complexe de protéine. Trois exemples de cette technique sont indiqués dans la section applications, y compris la détection des biomarqueurs pour l’initiation de la maladie et de progrès, suivi de traitement chez les patients et l’étude des protéines suite à une modification post-traductionnelle (PTM).

Deux dimensions, ou 2D, électrophorèse de gel est une technique utilisant les deux méthodes de séparation distincte qui peuvent séparer les milliers de protéines à partir d’un mélange unique. Une des techniques, SDS-PAGE ou le sodium dodecyl sulfate sur gel de polyacrylamide, ne peut pas complètement séparer des mélanges complexes. Électrophorèse sur gel 2D couples le SDS-PAGE à une deuxième méthode, isoélectrique se concentrant ou IEF, qui sépare basé sur les points isoélectriques, permettant la résolution de potentiellement toutes les protéines dans une cellule de lysat. Cette vidéo va montrer que les principes de la 2D gel électrophorèse, une procédure générale et certaines de ses applications biomédicales.

Électrophorèse sur gel 2D commence par IEF comme la première dimension. Chaque protéine a une valeur de pH, appelée point isoélectrique ou pI, où la charge nette est nulle. Lorsqu’une protéine est soumise à un champ électrique, elle se déplacera vers l’électrode de charge opposée. Échantillons d’intérêt sont chargés sur gradient de pH immobilisé, ou des IPG, les bandes qui ont incorporé des ampholytes, molécules contenant des groupes acides et basique. Un champ électrique est ensuite appliqué à la bande de gradient de pH, causant les protéines à migrer jusqu'à atteindre la valeur du pH correspondant à leur pI, où ils perdent leur charge nette.

Avant d’exécuter la seconde dimension, les protéines incorporées sont traités avec le SDS, leur dénaturation et fournissant une charge négative uniforme. Une fois terminé, les bandes IPG sont placés sur un gel de polyacrylamide. Un champ électrique appliqué attire les protéines vers l’anode, avec les plus grandes protéines se déplaçant plus lentement à travers le gel.

Une fois le mélange de protéines a été séparé selon pI et poids moléculaire, la carte du protéome est visualisée à l’aide de taches, et les protéines d’intérêt sont identifiées.

Maintenant que nous avons discuté des principes de l’électrophorèse sur gel 2D, Let ' s go sur une procédure de laboratoire typique.

Que l’expérience puisse être effectuée, les protéines doivent être solubilisées dans les médias. La solubilisation de l’échantillon est obtenue en additionnant des protéines avec une combinaison d’agents chaotropiques pour perturber les interactions hydrogènes, détergents non ioniques pour empêcher la modification des frais des protéines, agents réducteurs pour briser les liaisons disulfure et met en mémoire tampon. Pour enlever les protéines abondantes interférentes et autres molécules, le matériel est séquentiellement extrait par centrifugation et collection de la pastille qui en résulte ; suivi du traitement par l’endonucléase, enzyme utilisée pour consommer tout ADN qui interférerait avec l’expérience.

Une fois que les protéines ont été solubilisés, bandes IPG sont préparés en rinçant avec une solution de nettoyage de bande et laissés sécher à l’envers. Chaque bande est alors attribué un numéro de titulaire de la bande. Une fois prêt, l’extrait cellulaire est chargé sur les bandes dans un lent mouvement coulissant partir du négatif à l’extrémité positive. Dans le but de réhydratation, papier buvard humide est placé sur le dessus de l’électrode et sous les bandes de gel ; les bandes IPG sont alors bordés sur l’instrument de l’IEF. Un fort courant électrique est appliqué, et les protéines commencent à migrer.

À l’issue de la première dimension, le gel SDS-page est préparé dans un appareil de coulage. Les bandes IPG sont traités en les plaçant face vers le bas dans le tampon d’équilibration contenant du SDS. L’appareil d’électrophorèse est peaufiné avec addition de tampon d’électrophorèse. Les bandes IPG traitées sont recueillies à l’aide de la pince à épiler, posé sur les plaques de gel et scellé avec une solution d’étanchéité d’agarose. Une source de tension puis applique un champ électrique, qui se tient jusqu'à ce que les protéines plus rapide de terrassement sont à 1 cm du bas du gel.

A l’issue de l’électrophorèse, les protéines doivent être visualisées. Traditionnellement, ceci est réalisé par coloration au bleu de Coomassie bleu ou argent nitrate. Protéines d’intérêt peuvent être transférées depuis le gel et analysés par l’analyse par Western blot.

Une deuxième approche d’identification implique l’excision des protéines du gel, digérant, que leur analyse par spectrométrie de masse.

Maintenant que nous avons passé en revue une procédure, nous allons étudier certaines des utilisations pour électrophorèse 2D.

Une des utilisations plus courantes de cette technique est l’identification des molécules impliquées dans la progression et l’initiation de la maladie. Électrophorèse de gel 2D, couplée à la spectrométrie de masse, peut détecter l’ou vers le bas-régulation des protéines spécifiques dans les zones malades par rapport à celles qui sont saines.

En outre, électrophorèse 2D est utile pour suivre le progrès de la réponse des patients à un médicament thérapeutique potentiel. Spécimens peuvent être prises chez les patients à différents intervalles après l’administration du traitement. De cette façon, électrophorèse 2D couplée avec la tache occidentale ou l’analyse de spectrométrie de masse, peut détecter des protéines associées aux réponses négatives telles que l’inflammation ; ou l’absence de protéines dans un État allégé.

Un autre usage pour électrophorèse 2D est l’étude de la structure des protéines et la fonction après modification post-traductionnelle ou PTM, qui sont des ajouts aux protéines suite à leur traduction de l’ARNm. PTM peut réglementer une variété de fonctions, y compris les protéines de signalisation, l’expression des gènes, ou causer des dommages oxydatifs. Électrophorèse de gel 2D est sensible aux modifications telles que la méthylation ou acétylation, qui peut provoquer un changement dans la pI ainsi que le poids moléculaire.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE par électrophorèse sur gel 2D. Cette vidéo décrit les principes de la technique, une procédure expérimentale typique et plusieurs de ses applications dans le domaine de la biomédecine.

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JoVE Science Education Database. L'essentiel de la biochimie. Électrophorèse bidimensionnelle. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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