Etiquetado metabólico

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Etiquetado metabólico se utiliza para probar las transformaciones bioquímicas y modificaciones que ocurren en una célula. Esto se logra mediante el uso de análogos químicos que imitan la estructura de biomoléculas naturales. Las células utilizan análogos en sus procesos bioquímicos endógenos, produciendo compuestos que están etiquetados. La etiqueta permite la incorporación de la detección y etiquetas de afinidad que pueden utilizarse para aclarar las vías metabólicas mediante otras técnicas de análisis bioquímicos, como SDS-PAGE y RMN.

Este video presenta los conceptos de etiquetado y mostrar dos generales procedimientos metabólicos.  La primera utiliza etiquetado isotópico, para caracterizar la fosforilación de una proteína. La segunda cubre un etiquetado fotoreactivas para caracterizar la interacción proteína-proteína dentro de un también tres aplicaciones de etiquetado metabólico presentan: etiquetado de material vegetal, etiquetado RNA para medir la cinética y glicanos en el desarrollo de embriones.

Etiquetado metabólico se utiliza para investigar la maquinaria de una célula. Esto se logra utilizando químicos análogos para las transformaciones bioquímicas y modificaciones que se producen. Este video le mostrará los principios de etiquetado metabólico, típico isotópica y fotoreactivas etiquetado procedimientos y aplicaciones.

Etiquetado metabólico puede realizarse mediante una serie de estrategias. Aquí describiremos etiquetado isotópico, fotoreactivas y bio-ortogonales.

Etiquetado isotópico se realiza utilizando análogos estructurales que son químicamente idénticos a sus contrapartes naturales, pero han incorporado isótopos poco comunes en su estructura. En este análogo de L-lisina se reemplazan los átomos de carbono y nitrógeno con carbono 13 y nitrógeno-15. Las células cultivadas en presencia de análogos isotópicos incorporen a sus estructuras bioquímicas. Metabolitos son recogidos de las células y purifica para el análisis. Las muestras con los isótopos estables se analizan mediante técnicas como la espectrometría de masas o espectroscopia NMR. Las muestras con etiquetas radiactivas se analizan utilizando películas de centelleo líquido contando y rayos x, lo que se demostrará en el protocolo de etiquetado isotópico.

Etiquetas fotoreactivas son grupos funcionales incorporados en las proteínas, que son estables hasta que expuesto a la luz ultravioleta. El grupo funcional forma a un radical reactivo, que se une a la proteína más cercana. Un ejemplo común, Foto-L-leucina, contiene un anillo diazirine, que es un crosslinker fotoreactivos. En contraste con etiquetado isotópico, hay algunos químico desemejanza entre foto-reactivos químicos análogos y sus contrapartes naturales. Las células pueden incorporar preferentemente compuestos naturales sobre análogos. Por lo tanto, es importante realizar etiquetado foto-reactivo en el medio libre del compuesto que mímico. Una vez expuesto a la radiación ultravioleta, los grupos foto-reactiva en una proteína marcada se convierten en inestable y altamente reactiva, haciendo que reaccione con las proteínas obran recíprocamente, creando una proteína compleja. Los complejos reticulados, actúan como instantáneas que luego pueden ser analizadas utilizando SDS-PAGE y los métodos de espectrometría de masas. Esto proporciona penetraciones en qué reacciones se producen en la vía metabólica mediante la identificación de especies de la reacción y cómo interactúan en la determinación de sitios de Unión.

Etiquetado estrategias de Bioorthogonal utilizan análogos con pequeños grupos funcionales que no tienen poca o ninguna reactividad con biomoléculas naturales. Por ejemplo, azidas son pequeños grupos funcionales, cuya reactividad se dice que es ortogonal a las reacciones bioquímicas. En la ligadura de Staudinger, un grupo de fosfino ataca el grupo azido. Esto produce un estado de transición que intramolecularly reacciona con un éster cercanos, dando por resultado un ligando amina-consolidado. Grupos funcionales de Bioorthogonal incorporados en biomoléculas pueden ligarse con las etiquetas de detección tales como fluorescentes grupos funcionales, y afinidad etiquetas como antígenos.

Ahora que se han discutido algunos conceptos y estrategias para el etiquetado metabólico, veamos el proceso en el laboratorio.

El primer paso en un experimento etiquetado metabólico es recoger la proteína de interés. Para ello, las células se cultivan en un plato, y se utiliza un método de expresión para promover la síntesis de la proteína deseada. En este ejemplo, quinasas repetición rica en leucina o LRRK, expresan. Fosfato disódico, que contiene fósforo-32 radioactivo, es utilizado como la analógica. Deberán tomarse las medidas adecuadas para proteger contra las radiaciones ionizantes. Esto incluye la creación de un área de trabajo, usando equipo de protección adecuado y comprobación de contaminación radiactiva. Una vez que se han tomado medidas de seguridad, el medio que contiene los isótopos análogos está preparado. El medio de la cultura es eliminado y reemplazado con uno que contiene los isótopos químicos análogos y luego se incubaron. Tras la incubación, las células son sometidas a lisis. El lisado es recogido y purificado.

Después de la purificación, las proteínas se resuelven utilizando SDS-PAGE y luego se transfiere a una membrana PVDF. Autorradiografía se realiza exponiendo la membrana para la película de rayos x y mide usando a un sensor de fósforo. Western Blot se utiliza para medir niveles relativos de la proteína en la membrana PVDF. En este ejemplo los niveles de fosforilación de ricos en leucina repetición quinasas sintetizan en midieron las células 293T. Cuánto fósforo se muestra en el autoradiogram fue incorporado en la proteína. El borrar occidental aclara los niveles de las proteínas LRRK. Software de análisis de imagen se utiliza para obtener datos cuantitativos de los niveles de fosforilación de las proteínas.

En este procedimiento siguiente, etiquetado fotoreactivas es demostrado. En primer lugar, las células son preparadas y cultivadas. El análogo fotoreactivos es añadido a las células en la fase de registro medio y se incubaron. En este procedimiento se utiliza p-benzoylphenylalanine. Las muestras se recogen sobre intervalos y puesto en el hielo. Las muestras se exponen para obtener instantáneas de las vías bioquímicas con el tiempo. Las proteínas de interés son entonces purificaron y resuelven mediante SDS-PAGE.

Se utilizó una estrategia etiquetadora fotoreactivas para identificar compuestos que interactúan con la proteína de interés. Inmunodetección con Western Blot bandas de proteínas muestra que indican mayor peso molecular las proteínas están presentes en las muestras irradiadas. Estas son de cross-linking debido a la interacción de proteínas que se producen durante la irradiación UV.

Ahora que hemos analizado los procedimientos Etiquetadoras metabólicos, echemos un vistazo a algunas de las formas que es utilizar el proceso.

Conceptos Etiquetadoras metabólicos pueden ampliarse a los organismos multicelulares. Plantas se cultivan en un ambiente sellado, ricas en isótopos estables para material vegetal producido de etiquetado. Dióxido de carbono con carbono-13 se añade al recinto, mientras que el nitrógeno-15 se usa fertilizante rico. El material resultante de la planta cosechada puede ayudar a responder preguntas sobre el carbono y nitrógeno ciclo del ecosistema.

Etiquetado permite la separación del ARN recién sintetizado del ARN más viejo. Cambiando la concentración inicial de análogo, se puede determinar la cinética de la nueva síntesis de ARN. Los resultados muestran que la concentración de 4-thiouridine afecta a la cuanta nuevo RNA se transcribe. Además, las tasas de incorporación de la etiqueta en el RNA se pueden cuantificar directamente con un espectrofotómetro.

Mediante la química del tecleo de biorthogonal, puede etiquetarse glycans en un embrión de pez cebra. Los huevos son inyectados con un producto etiquetado que resulta en las etiquetas de alquino de los glicanos. Los glicanos de las larvas se unen entonces a un compuesto del tinte en la etapa de desarrollo deseado. Entonces son imágenes de los glicanos en los embriones. Glycans producidos en diferentes puntos temporales pueden identificarse por etiquetado utilizando diferentes colores en las diferentes etapas del desarrollo embrionario.

Sólo has visto video de Zeus en el etiquetado metabólico. Este video describe los conceptos de etiquetado metabólico y sus estrategias, pasó dos procedimientos generales y había cubierto algunos de los usos de las técnicas.

¡Gracias por ver!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Etiquetado metabólico. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE

Applications