Overview
A rotulagem metabólica é usada para sondar as transformações bioquímicas e modificações que ocorrem em uma célula. Isso é feito usando análogos químicos que imitam a estrutura de biomoléculas naturais. As células utilizam análogos em seus processos bioquímicos endógenos, produzindo compostos que são rotulados. O rótulo permite a incorporação de tags de detecção e afinidade, que podem então ser usadas para elucidar vias metabólicas utilizando outras técnicas analíticas bioquímicas, como SDS-PAGE e NMR.
Este vídeo introduz os conceitos de rotulagem metabólica e mostra dois procedimentos gerais. O primeiro usa rotulagem isotópica, para caracterizar a fosforilação de uma proteína. A segunda abrange uma rotulagem fotoreativa para caracterizar a interação proteína-proteína dentro de um Também são apresentadas três aplicações de rotulagem metabólica: rotulagem de material vegetal, rotulagem de RNA para medir cinética e rotulagem de glicocanos no desenvolvimento de embriões.
A rotulagem metabólica é usada para investigar o maquinário de uma célula. Isso é feito usando análogos químicos para sondar as transformações bioquímicas e modificações que ocorrem. Este vídeo mostrará os princípios da rotulagem metabólica, procedimentos típicos de rotulagem isotópica e fotoreativa, e algumas aplicações.
A rotulagem metabólica pode ser conduzida utilizando uma série de estratégias. Aqui descreveremos a rotulagem isotópica, fotoreativa e bio-ortogonal.
A rotulagem isotópica é realizada usando análogos estruturais que são quimicamente idênticos às suas contrapartes naturais, mas têm isótopos incomuns incorporados em sua estrutura. Neste análogo L-lysine os átomos de carbono e nitrogênio são substituídos por carbono-13 e nitrogênio-15. Células cultivadas na presença de análogos isotópicos as incorporarão em suas estruturas bioquímicas. Metabólitos são coletados das células e purificados para análise. Amostras com isótopos estáveis são analisadas utilizando técnicas como espectrometria de massa ou espectroscopia de RN. Amostras com rótulos radioativos são analisadas utilizando-se a contagem de cintilação líquida e filmes de raio-x, que serão demonstrados no protocolo de rotulagem isotópica.
Rótulos fotoretivos são grupos funcionais incorporados em proteínas, que são estáveis até serem expostas à luz ultravioleta. O grupo funcional forma um radical reativo, que se liga à proteína mais próxima. Um exemplo comum, L-photo-leucine, contém um anel diazirina, que é um crosslinker fotoretivo. Em contraste com a rotulagem isotópica, há alguma diferença química entre os análogos químicos foto-reativos e suas contrapartes naturais. As células podem incorporar preferencialmente compostos naturais sobre análogos. Por isso, é importante realizar rotulagem foto-reativa em meio livre do composto que está sendo imitado. Uma vez expostos à radiação ultravioleta, os grupos foto-reativos em uma proteína rotulada tornam-se instáveis e altamente reativos, fazendo com que ela se conecte com proteínas interativas, criando um complexo proteico. Complexos intercriados, agem como instantâneos que podem ser analisados usando métodos de espectrometria de SDS-PAGE e de massa. Isso fornece insights sobre quais reações estão ocorrendo na via metabólica, identificando espécies de reação e como elas interagem determinando locais de ligação.
Estratégias bioortogonais de rotulagem utilizam análogos com pequenos grupos funcionais que têm pouca ou nenhuma reatividade com biomoléculas naturais. Por exemplo, azides são pequenos grupos funcionais, cuja reatividade é considerada ortogonal para reações bioquímicas. Na ligadura de Staudinger, um grupo de fosfina ataca o grupo azido. Isso produz um estado de transição que reage intramolecularmente com um éster próximo, resultando em um ligante ligado a amina. Grupos funcionais bioortogonais incorporados em biomoléculas podem ser ligados com marcas de detecção, como grupos funcionais fluorescentes, e tags de afinidade, como antígenos.
Agora que alguns conceitos e estratégias para rotulagem metabólica foram discutidos, vamos olhar para o processo em laboratório.
O primeiro passo de um experimento de rotulagem metabólica é coletar a proteína do interesse. Para isso, as células são cultivadas em um prato, e um método de expressão é usado para promover a síntese da proteína desejada. Neste exemplo, as quinases repetidas ricas em leucina, ou LRRK, são expressas. Fosfato desódico, contendo fósforo radioativo-32, é usado como análogo. Medidas adequadas devem ser tomadas para proteger contra radiação ionizante. Isso inclui a criação de uma área de trabalho, o uso de equipamentos de proteção adequados e a verificação de contaminação radioativa. Uma vez tomadas medidas de segurança, o meio contendo os análogos isotópicos é preparado. O meio da cultura é removido e, substituído por um contendo os análogos químicos isotópicos e depois incubado. Após a incubação, as células são diluidas. O lise é coletado e purificado.
Após a purificação, as proteínas são resolvidas usando SDS-PAGE e depois transferidas para uma membrana PVDF. A autordiografia é realizada expondo a membrana ao filme de raio-x e medida por meio de um imager de fósforo. A mancha ocidental é usada para medir níveis relativos de proteína na membrana PVDF. Neste exemplo, foram medidos os níveis de fosforilação das quinases repetidas ricas em leucinas sintetizadas em células 293T. O autordiograma mostra o quanto o fósforo foi incorporado à proteína. A mancha ocidental elucida os níveis das proteínas LRRK. O software de análise de imagens é usado para obter dados quantitativos dos níveis de fosforilação das proteínas.
Neste próximo procedimento, a rotulagem fotoreativa é demonstrada. Primeiro, as células são preparadas e cultivadas. O analógico fotoretivo é adicionado às células na fase de registro médio e incubado. Neste procedimento é utilizado p-benzoilfenilalanina. As amostras são coletadas ao longo de intervalos e colocadas no gelo. As amostras são então expostas para obter instantâneos das vias bioquímicas ao longo do tempo. As proteínas de interesse são então purificadas e resolvidas usando SDS-PAGE.
Uma estratégia de rotulagem fotoreativa foi utilizada para identificar compostos que interagem com a proteína de interesse. A imunodetodoca com manchas ocidentais mostra bandas de proteínas que indicam que proteínas de maior peso molecular estão presentes nas amostras irradiadas. Estes são de ligação cruzada devido à interação proteína-proteína que ocorre durante a irradiação UV.
Agora que revisamos os procedimentos de rotulagem metabólica, vamos ver algumas das maneiras como o processo é usado.
Conceitos de rotulagem metabólica podem ser estendidos a organismos multicelulares. As plantas são cultivadas em um ambiente selado, rico em isótopos estáveis para material vegetal rotulado produzido. O dióxido de carbono contendo carbono-13 é adicionado ao recinto, enquanto o fertilizante rico em nitrogênio-15 é usado. O material vegetal colhido resultante pode ajudar a responder perguntas sobre o ciclismo de carbono e nitrogênio do ecossistema.
A rotulagem permite a separação do RNA recém-sintetizado do RNA mais antigo. Alterando a concentração inicial de analógico, a cinética da nova síntese de RNA pode ser determinada. Os resultados mostram que a concentração de 4-thiouridina afeta a quantidade de novo RNA transcrito. Além disso, as taxas de incorporação do rótulo em RNA podem ser diretamente quantificadas com um espectrômetro.
Usando química de clique biorthogonal, glicos em um embrião de peixe zebra podem ser rotulados. Os ovos são injetados com um composto de rotulagem que resulta em rótulos de alkyne nos glicanos. Os glicanos nas larvas são então ligados a um composto de corante na fase de desenvolvimento desejada. Os glicanos nos embriões são então imagens. Os glicanos produzidos em diferentes pontos de tempo podem ser identificados rotulando usando cores diferentes em diferentes estágios do desenvolvimento de embriões.
Você acabou de ver o vídeo de JoVE sobre rotulagem metabólica. Este vídeo descreveu os conceitos por trás da rotulagem metabólica e suas estratégias, passou por dois procedimentos gerais e cobriu alguns dos usos das técnicas.
Obrigado por assistir!
Procedure
A rotulagem metabólica é usada para sondar as transformações bioquímicas e modificações que ocorrem em uma célula. Isso é feito usando análogos químicos que imitam a estrutura de biomoléculas naturais. As células utilizam análogos em seus processos bioquímicos endógenos, produzindo compostos que são rotulados. O rótulo permite a incorporação de tags de detecção e afinidade, que podem então ser usadas para elucidar vias metabólicas utilizando outras técnicas analíticas bioquímicas, como SDS-PAGE e NMR.
Este vídeo introduz os conceitos de rotulagem metabólica e mostra dois procedimentos gerais. O primeiro usa rotulagem isotópica, para caracterizar a fosforilação de uma proteína. A segunda abrange uma rotulagem fotoreativa para caracterizar a interação proteína-proteína dentro de um Também são apresentadas três aplicações de rotulagem metabólica: rotulagem de material vegetal, rotulagem de RNA para medir cinética e rotulagem de glicocanos no desenvolvimento de embriões.
A rotulagem metabólica é usada para investigar o maquinário de uma célula. Isso é feito usando análogos químicos para sondar as transformações bioquímicas e modificações que ocorrem. Este vídeo mostrará os princípios da rotulagem metabólica, procedimentos típicos de rotulagem isotópica e fotoreativa, e algumas aplicações.
A rotulagem metabólica pode ser conduzida utilizando uma série de estratégias. Aqui descreveremos a rotulagem isotópica, fotoreativa e bio-ortogonal.
A rotulagem isotópica é realizada usando análogos estruturais que são quimicamente idênticos às suas contrapartes naturais, mas têm isótopos incomuns incorporados em sua estrutura. Neste análogo L-lysine os átomos de carbono e nitrogênio são substituídos por carbono-13 e nitrogênio-15. Células cultivadas na presença de análogos isotópicos as incorporarão em suas estruturas bioquímicas. Metabólitos são coletados das células e purificados para análise. Amostras com isótopos estáveis são analisadas utilizando técnicas como espectrometria de massa ou espectroscopia de RN. Amostras com rótulos radioativos são analisadas utilizando-se a contagem de cintilação líquida e filmes de raio-x, que serão demonstrados no protocolo de rotulagem isotópica.
Rótulos fotoretivos são grupos funcionais incorporados em proteínas, que são estáveis até serem expostas à luz ultravioleta. O grupo funcional forma um radical reativo, que se liga à proteína mais próxima. Um exemplo comum, L-photo-leucine, contém um anel diazirina, que é um crosslinker fotoretivo. Em contraste com a rotulagem isotópica, há alguma diferença química entre os análogos químicos foto-reativos e suas contrapartes naturais. As células podem incorporar preferencialmente compostos naturais sobre análogos. Por isso, é importante realizar rotulagem foto-reativa em meio livre do composto que está sendo imitado. Uma vez expostos à radiação ultravioleta, os grupos foto-reativos em uma proteína rotulada tornam-se instáveis e altamente reativos, fazendo com que ela se conecte com proteínas interativas, criando um complexo proteico. Complexos intercriados, agem como instantâneos que podem ser analisados usando métodos de espectrometria de SDS-PAGE e de massa. Isso fornece insights sobre quais reações estão ocorrendo na via metabólica, identificando espécies de reação e como elas interagem determinando locais de ligação.
Estratégias bioortogonais de rotulagem utilizam análogos com pequenos grupos funcionais que têm pouca ou nenhuma reatividade com biomoléculas naturais. Por exemplo, azides são pequenos grupos funcionais, cuja reatividade é considerada ortogonal para reações bioquímicas. Na ligadura de Staudinger, um grupo de fosfina ataca o grupo azido. Isso produz um estado de transição que reage intramolecularmente com um éster próximo, resultando em um ligante ligado a amina. Grupos funcionais bioortogonais incorporados em biomoléculas podem ser ligados com marcas de detecção, como grupos funcionais fluorescentes, e tags de afinidade, como antígenos.
Agora que alguns conceitos e estratégias para rotulagem metabólica foram discutidos, vamos olhar para o processo em laboratório.
O primeiro passo de um experimento de rotulagem metabólica é coletar a proteína do interesse. Para isso, as células são cultivadas em um prato, e um método de expressão é usado para promover a síntese da proteína desejada. Neste exemplo, as quinases repetidas ricas em leucina, ou LRRK, são expressas. Fosfato desódico, contendo fósforo radioativo-32, é usado como análogo. Medidas adequadas devem ser tomadas para proteger contra radiação ionizante. Isso inclui a criação de uma área de trabalho, o uso de equipamentos de proteção adequados e a verificação de contaminação radioativa. Uma vez tomadas medidas de segurança, o meio contendo os análogos isotópicos é preparado. O meio da cultura é removido e, substituído por um contendo os análogos químicos isotópicos e depois incubado. Após a incubação, as células são diluidas. O lise é coletado e purificado.
Após a purificação, as proteínas são resolvidas usando SDS-PAGE e depois transferidas para uma membrana PVDF. A autordiografia é realizada expondo a membrana ao filme de raio-x e medida por meio de um imager de fósforo. A mancha ocidental é usada para medir níveis relativos de proteína na membrana PVDF. Neste exemplo, foram medidos os níveis de fosforilação das quinases repetidas ricas em leucinas sintetizadas em células 293T. O autordiograma mostra o quanto o fósforo foi incorporado à proteína. A mancha ocidental elucida os níveis das proteínas LRRK. O software de análise de imagens é usado para obter dados quantitativos dos níveis de fosforilação das proteínas.
Neste próximo procedimento, a rotulagem fotoreativa é demonstrada. Primeiro, as células são preparadas e cultivadas. O analógico fotoretivo é adicionado às células na fase de registro médio e incubado. Neste procedimento é utilizado p-benzoilfenilalanina. As amostras são coletadas ao longo de intervalos e colocadas no gelo. As amostras são então expostas para obter instantâneos das vias bioquímicas ao longo do tempo. As proteínas de interesse são então purificadas e resolvidas usando SDS-PAGE.
Uma estratégia de rotulagem fotoreativa foi utilizada para identificar compostos que interagem com a proteína de interesse. A imunodetodoca com manchas ocidentais mostra bandas de proteínas que indicam que proteínas de maior peso molecular estão presentes nas amostras irradiadas. Estes são de ligação cruzada devido à interação proteína-proteína que ocorre durante a irradiação UV.
Agora que revisamos os procedimentos de rotulagem metabólica, vamos ver algumas das maneiras como o processo é usado.
Conceitos de rotulagem metabólica podem ser estendidos a organismos multicelulares. As plantas são cultivadas em um ambiente selado, rico em isótopos estáveis para material vegetal rotulado produzido. O dióxido de carbono contendo carbono-13 é adicionado ao recinto, enquanto o fertilizante rico em nitrogênio-15 é usado. O material vegetal colhido resultante pode ajudar a responder perguntas sobre o ciclismo de carbono e nitrogênio do ecossistema.
A rotulagem permite a separação do RNA recém-sintetizado do RNA mais antigo. Alterando a concentração inicial de analógico, a cinética da nova síntese de RNA pode ser determinada. Os resultados mostram que a concentração de 4-thiouridina afeta a quantidade de novo RNA transcrito. Além disso, as taxas de incorporação do rótulo em RNA podem ser diretamente quantificadas com um espectrômetro.
Usando química de clique biorthogonal, glicos em um embrião de peixe zebra podem ser rotulados. Os ovos são injetados com um composto de rotulagem que resulta em rótulos de alkyne nos glicanos. Os glicanos nas larvas são então ligados a um composto de corante na fase de desenvolvimento desejada. Os glicanos nos embriões são então imagens. Os glicanos produzidos em diferentes pontos de tempo podem ser identificados rotulando usando cores diferentes em diferentes estágios do desenvolvimento de embriões.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
