Cristalización de proteínas

Biochemistry

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Summary

Cristalización de proteínas, obteniendo un sólido entramado de biomoléculas, aclara la estructura de la proteína y permite el estudio de la función de la proteína. Cristalización consiste en secado purificado de la proteína en una combinación de muchos factores, incluyendo el pH, temperatura, fuerza iónica y concentración de la proteína. Una vez que se obtienen cristales, la estructura de la proteína puede ser aclarada por difracción de rayos x y el cómputo de un modelo de densidad de electrones.

Este video presenta la cristalización de proteínas y muestra un procedimiento general. Expresión de la proteína y purificación, cristalización y difracción de rayos x están cubiertos en el procedimiento. Aplicaciones de la cristalización de proteínas incluyen en silico drogas de diseño, determinación del sitio de enlace y análisis de estructura de proteínas de membrana.

Cristalización de proteínas es el proceso de obtener una forma sólida celosía de una proteína. Estos cristales son especialmente valiosos para los biólogos estructurales, ayudar en el estudio de la función de la proteína. Otras técnicas, como la masa spec o SDS-PAGE, sólo pueden proporcionar información sobre la estructura unidimensional de las proteínas. Cristalización de proteínas se complementa con las técnicas de expresión de la proteína recombinante y difracción de rayos x. Este video le mostrará los principios de la cristalización de proteínas, un procedimiento de laboratorio general y varias de sus aplicaciones en el campo de la bioquímico.

El primer paso necesario en el proceso es obtener cantidades de miligramos de proteínas muy puras, normalmente utilizando la expresión de proteína recombinante. El gen correspondiente a la proteína de interés se clona en un vector de expresión, y la proteína expresada se fusiona a una etiqueta de afinidad, como poli-histidina, para ayudar en la purificación por cromatografía de afinidad. Para más información, ver vídeo de la colección en cromatografía de afinidad.

Formación de la proteína purificada en cristales depende de la adecuada combinación de muchos factores, incluyendo pH, fuerza iónica, concentración de precipitado y proteína, temperatura y tasa de equilibrio. El método más comúnmente usado es la difusión de vapor, de que hay dos categorías: colgante gota y gota sentada. Una gota que contiene proteína pura, tampón y precipitado, que es un iónico sólido une las moléculas de agua, reduciendo la disponibilidad de agua de la proteína y mímico la mayor concentración de proteína, es en un pocillo cerrado con un depósito con una mezcla más concentrada del mismo tampón de precipitado. Al principio, las concentraciones de proteína y precipitado son demasiado bajas para causar cristalización. Durante el curso del experimento, el agua se vaporiza de la gota y se acumula en el depósito; una disminución en la cantidad de agua en la gota hace que el sistema que se convierte sobresaturado, y nucleación, seguido de cristalización, puede ocurrir. La transferencia neta de agua de la gota está en equilibrio, y el sistema se mantiene hasta que finalice el proceso.

Para visualizar la estructura 3D, utiliza difracción de rayos x. Para obtener los datos de rayos x de un cristal, se coloca en un haz de rayos x monocromáticos, donde es expuesta al haz en todos los ángulos. Cada exposición proporciona una imagen, donde cada punto es una radiografía difracción, que emerge del cristal y es registrada por un detector. Los datos se combinan para producir un modelo del arreglo de átomos dentro del cristal. La estructura de cristal resultante muestra la colocación de 3 dimensiones de los átomos, con una resolución típica de 2 angstroms.

Ahora que hemos cubierto los principios de la cristalización de proteínas, veamos un protocolo generalizado.

Para comenzar el procedimiento se transforma un vector de expresión que contiene el gen de interés en las células. Se incuban las células y en la fase de registro medio, expresión se inicia mediante la adición de un inductor, como IPTG, que desencadena la transcripción de mRNA del gen. Después de la expresión de la proteína, el material crudo es suspendido en tampón de lisis y luego se clarifica por centrifugación.

El clarificado lisado es entonces cargado en una columna de níquel, y la proteína polyhistidine-etiqueta se une a la columna mientras que otras biomoléculas son arrastrados.

Una vez que se han obtenido varios miligramos de proteína pura, está listo para la cristalización por difusión de vapor. Una bandeja de 24 pocillos de estar colgando gota está lleno de diversas concentraciones de cloruro de sodio y soluciones de tampón de acetato de sodio. Método de la gota de la sesión, volúmenes iguales de solución de proteína y depósito se pipetea en el estante encima de cada pozo, y luego se cubre la bandeja con cinta transparente. La bandeja se coloca en una cámara de incubación, y los pozos se monitorean para crecimiento al día siguiente, entonces todos los días.

Una vez que un cristal adecuado se han obtenido está listo para el análisis de difracción de rayos x. El cristal está montado sobre un goniómetro para colocar el cristal en las orientaciones. El cristal se ilumina con un haz monocromático de rayos x en todos los ángulos, produciendo un patrón de difracción. El software convierte imágenes de dos dimensiones, en diferentes orientaciones, a un modelo tridimensional de la densidad de electrones dentro del cristal mediante la determinación de las posiciones de los átomos en el cristal.

Ahora que hemos repasado un procedimiento, vamos a revisar algunas aplicaciones útiles de la cristalización de proteínas y otra técnica de cristalización.

Cristalización de proteínas puede ser usada para en silico drogas de diseño. Se determinó la estructura tridimensional de la polimerasa proteína básica Influenza virus 2, que se ha ligado a la infección viral en los mamíferos, por la cristalización y difracción de rayos x. Se visualizan posibles sitios de Unión en la proteína, y con el uso de un programa de docking, fue diseñada una molécula tridimensional que se inserte en una hendidura de la proteína.

La cristalización de complejos de proteína-DNA es también una técnica útil. Proteínas de unión a ADN modulan una amplia variedad de funciones biológicas tales como transcripción y polimerización de la DNA y la reparación del ADN; y las estructuras cristalinas de estos complejos pueden proporcionar la penetración en función de la proteína, mecanismo y la naturaleza de la interacción específica. La proteína de e. coli SeqA, un regulador negativo de la replicación del ADN, fue co cristalizada con hemimethylated la DNA.

Proteínas de membrana integral como g-Proteína había unida receptores o GCPRs, son difíciles de cristalizar debido a su cantidad limitada polar de área de superficie disponible para la formación de contactos de enrejado cristalino, que ha llevado al desarrollo de la cristalización de proteínas asistida por la proteína de fusión. Genes que codifican receptores adrenérgicos β2, un GCPR y una lisozima se insertan en un vector de expresión. La cristalización de la proteína de fusión β2AR lisozima se logró debido a la mayor superficie hidrofílica extracelular sobre la β2AR naturalmente hidrofóbico, proporcionado por la lisozima, necesaria para la formación de interacciones de embalaje en el enrejado cristalino.

Sólo has visto video de Zeus sobre cristalización de proteínas. Este video describe sus principios, un protocolo generalizado y algunos sus usos en el campo biomédico. ¡Gracias por ver!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Cristalización de proteínas. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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