Summary
इस प्रक्रिया का वर्णन कैसे murine अस्थि मज्जा से प्राथमिक hematopoietic सेल संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए है और जीन Pulser MXCell electroporation प्रणाली का उपयोग अभिकर्मक द्वारा पीछा किया.
Abstract
यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि electroporation प्राथमिक कोशिकाओं में डीएनए प्लाज्मिड या siRNA परिचय का सबसे प्रभावी तरीका है. जीन Pulser MXcell electroporation प्रणाली और जीन Pulser electroporation बफर विशेष रूप स्तनधारी कोशिकाओं और मुश्किल transfect कोशिकाओं, जैसे प्राथमिक और स्टेम cells.This वीडियो में न्यूक्लिक एसिड transfect विकसित किया गया दर्शाता है कि कैसे murine अस्थि मज्जा से प्राथमिक hematopoietic सेल संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए , और फिर उन्हें MXcell प्रणाली में electroporation के लिए तैयार है. हम जांध की हड्डी और टिबिअ अलग के द्वारा शुरू करते हैं. दोनों जांध की हड्डी और टिबिअ से अस्थि मज्जा तो harvested रहे हैं और संस्कृतियों स्थापित कर रहे हैं. संवर्धित अस्थि मज्जा की कोशिकाओं तो और विश्लेषण ट्रांसफ़ेक्ट हैं.
Protocol
Femurs और Tibiae से अस्थि मज्जा फसल काटने वाले
- 12 सप्ताह पुरानी माउस (हम BALB / ग चूहों का उपयोग कर रहे हैं, लेकिन आप किसी भी माउस तनाव के साथ इस प्रक्रिया कर सकते हैं) - प्रक्रिया का पहला कदम femurs और एक 6 के tibiae से अस्थि मज्जा फसल है. शुरू करने के लिए, सीओ 2 साँस लेना (नहीं दिखाया जाएगा) के द्वारा माउस euthanize. हार्वेस्ट और प्रत्येक के पिछले पैरों से फीमर tibiae. फिर, एक धार के साथ, femurs के प्रत्येक के अंत में कटौती के लिए कूल्हे और घुटने के जोड़ों को हटा दें और मज्जा बेनकाब.
- एक समान तरीके में, tibiae के प्रत्येक के अंत में कटौती के लिए घुटने और टखने सटे क्षेत्रों को हटाने और मज्जा बेनकाब.
- एक 26 गेज सुई के साथ एक 3 एमएल सिरिंज ले लो और यह 10% FBS, पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन, और बीटा mercaptoethanol (BME = 100 उम) के साथ पूरक RPMI के साथ भरने. चिमटी का प्रयोग, एक पेट्री युक्त पकवान RPMI मीडिया पर हड्डी पकड़. हड्डी का एक अंत में सिरिंज सुई डालें और अस्थि मज्जा फ्लश सवार दबाना. सिरिंज सुई अवशिष्ट मज्जा फ्लश हड्डी के अंदर ऊपर और नीचे स्थानांतरित कर सकते हैं.
- सभी हड्डियों के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ, और तब संस्कृतियों की स्थापना के साथ आगे बढ़ना.
संस्कृति की स्थापना
- अस्थि मज्जा संस्कृतियों स्थापित करने के लिए, प्लावित अस्थि मज्जा विंदुक ऊपर और नीचे कई बार एक सेल निलंबन में ऊतक को तोड़ने.
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर एक 70 माइक्रोन फिल्टर प्लेस, और फिल्टर करने के लिए सेल निलंबन जोड़ें.
- पेट्री डिश RPMI के साथ एक बार कुल्ला, तो जोड़ने के 70 माइक्रोन फिल्टर करने के लिए कुल्ला.
- 1 एमएल सिरिंज सवार रबर अंत का प्रयोग, अस्थि मज्जा 70 माइक्रोन फिल्टर के शीर्ष पर शेष टुकड़े पीसने.
- RPMI साथ फिल्टर एक बार धोएं.
- फिल्टर धोने के बाद 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
- पीबीएस में resuspending द्वारा गोली सेल धो लें.
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं को गिन लो. हम आम तौर पर ~ एक माउस हड्डियों (दो femurs से अधिक दो tibiae) से 90 मिलियन कोशिकाओं प्राप्त करते हैं. कोशिकाओं की गिनती के बाद उन्हें फिर से अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर.
- RPMI और उन्हें टिशू कल्चर पर्याप्त युक्त RPMI इतना है कि अंतिम एकाग्रता एमएल प्रति 1 मिलियन कोशिकाओं है बोतल में विभाज्य की एक छोटी राशि में कोशिकाओं Resuspend.
- साइटोकिन्स जोड़ें करने के लिए ब्याज की अपने सेल प्रकार के विकास को बढ़ावा देने के. इस मामले में, साइटोकाइन इंटरल्यूकिन 3 (आईएल 3 = 10 एनजी / एमएल) basophils और मस्तूल कोशिकाओं के विकास को बढ़ावा देने के लिए जोड़ा जाता है. Basophils अधिग्रहण करने के लिए, 10 दिनों के लिए सेते हैं. मस्तूल कोशिकाओं के लिए 5 हफ्तों के लिए सेते हैं. जब मस्तूल कोशिकाओं उत्पन्न, मीडिया और आईएल-3 सप्ताह में एक बार बदला जाना चाहिए.
- यहाँ कैसे मस्तूल कोशिकाओं चढ़ाना बस के बाद प्रकट करना चाहिए पर एक नज़र है. इस छवि को और 10 दिनों interleukin-3 के अलावा के बाद basophils और मस्तूल कोशिकाओं में मस्तूल मज्जा की कोशिकाओं के भेदभाव को दर्शाता है.
- एक बार वांछित कोशिका प्रकार प्राप्त है, electroporation कदम के साथ आगे बढ़ना.
Electroporating कक्ष
- Electroporation कदम शुरू करने के लिए, संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण करते हैं.
- कक्ष आम तौर पर एमएल प्रति 10 लाख की एक घनत्व electroporated हैं, तो शंक्वाकार ट्यूबों के लिए आवश्यक सेल नंबर हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
- Centrifuging के बाद, मीडिया aspirate, धोने 1X पीबीएस के साथ कोशिकाओं, और फिर 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- पीबीएस Aspirate और जैव रेड जीन Pulser electroporation बफर जोड़ने के लिए एमएल प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं का एक सेल निलंबन.
- कोशिकाओं resuspending के बाद, एमएल प्रति 10 से 20 micrograms की एक अंतिम एकाग्रता में वांछित डीएनए प्लाज्मिड जोड़ें.
- विभाज्य एक 96 अच्छी तरह electroporation प्लेट पर 150 अपनी पसंद के कुओं में सेल निलंबन के microliters.
- MXcell प्लेट चैम्बर में electroporation थाली रखो और ढक्कन बंद करें.
- मस्तूल कोशिकाओं के अभिकर्मक, एक electroporation प्रोटोकॉल से पहले एक पूर्व निर्धारित या संग्रहीत प्रोटोकॉल का उपयोग कर जब तक MXcell में क्रमादेशित किया जाना चाहिए. हम अनुकूलन प्रयोगों के माध्यम से पता चला है कि मस्तूल कोशिकाओं के उच्चतम अभिकर्मक क्षमता वर्ग तरंग पल्स प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए पाए जाते हैं. हम थाली पर electroporation भिन्न परिस्थितियों 2000uF और 1000 ohms पर 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms, और 350V/10ms वर्ग लहर दालों उद्धार करेगा. एक बार प्रोटोकॉल निर्धारित किया गया है और डिवाइस पर लोड है, "पल्स" प्रेस करने के लिए कोशिकाओं electroporate.
- Electroporation के बाद पूरा हो गया है, एक ऊतक संस्कृति की थाली करने के लिए कोशिकाओं हस्तांतरण. हम आम तौर पर 48 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति इंटरल्यूकिन 3 एमएल प्रति 10 nanograms के साथ 300 microliters RPMI (10% FCS, पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन, और बीटा mercaptoethanol के साथ पूरक) युक्त थाली में एक अच्छी तरह से प्रत्येक 150 microliter electroporation नमूना हस्तांतरण. कक्ष रातोंरात 37 में incubated हैं डिग्री सेल्सियस, तब अभिव्यक्ति और दमन के लिए 24 घंटे बाद assayed.
ट्रॅनsfection परिणाम
सफल एमएल GFP प्रति 20 micrograms प्लाज्मिड का उपयोग electroporation के बाद कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवि वीडियो में दिखाया गया है. MXcell के बारे में 30% की electroporation प्रणाली अभिकर्मक क्षमता का उपयोग प्राप्त किया जा सकता है. प्रणाली आप अपने अभिकर्मक क्षमता को अधिकतम करने के लिए भिन्न परिस्थितियों के लिए, जबकि सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए अनुमति देता है.
Discussion
है के रूप में और अधिक जीनोमिक जानकारी उभर रहे हैं और siRNA जैसे नए उपकरणों को विकसित कर रहे हैं, physiologically प्रासंगिक कोशिकाओं का उपयोग कभी अधिक महत्वपूर्ण बन गया है रोग रास्ते, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, और संकेत transduction की हमारी समझ को आगे. प्राथमिक कोशिकाओं ऊतकों या तरल पदार्थ से सीधे प्राप्त कर रहे हैं और इन विट्रो में खेती की जाती है. इन कोशिकाओं के तरीके, exogenous आनुवंशिक सामग्री के परिचय के माध्यम से सहित का एक संख्या में हेरफेर किया जा सकता है. यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि सबसे प्रभावी तरीका प्राथमिक कोशिकाओं में डीएनए प्लाज्मिड या siRNA परिचय electroporation है है.
Electroporation बिजली दालों के लिए कोशिकाओं को उजागर क्रम में करने के लिए transiently कोशिका झिल्ली की पारगम्यता वृद्धि हुई है, जिससे exogenous nucleic एसिड सेल में प्रवेश करने के लिए अनुमति. अभिकर्मक के इस विधि के लिए अलग सेल प्रकार / लाइनों और, इस प्रकार, मस्तूल कोशिकाओं transfect करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से किसी भी अन्य अस्थि मज्जा व्युत्पन्न सेल के बीच मतभेद के लिए समायोजित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा, वायरल की मध्यस्थता अभिकर्मक के विपरीत, electroporation ट्रांसफ़ेक्ट डीएनए के आकार पर सीमा लागू नहीं करता, न ही व्यापक तैयारी की आवश्यकता होती है. लिपिड मध्यस्थता अभिकर्मक के लिए इसके विपरीत, electroporation कम विषाक्त हो सकता है और ट्रांसफ़ेक्ट न्यूक्लिक एसिड के endosomal फँसाने में परिणाम नहीं कर सकते हैं.
जैव रेड MXcell electroporation प्रणाली विकसित की है विशेष रूप से इन कोशिकाओं के लिए. MXcell आप भिन्न परिस्थितियों करने के लिए अपने अभिकर्मक दक्षता और सेल व्यवहार्यता को अधिकतम अनुमति देता है. आदेश में अभिकर्मक दक्षता का अनुकूलन करने के लिए और कोशिका मृत्यु, वोल्टेज सहित electroporation मापदंडों के एक भीड़ को कम करने के लिए, समाई, प्रतिरोध, और नाड़ी की लंबाई और समायोजित किया जा सकता है मूल्यांकन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
