Summary
Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed è seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.
Abstract
E 'sempre più evidente che elettroporazione è il modo più efficace per introdurre DNA plasmidico o siRNA in cellule primarie. Il gene Pulser sistema di elettroporazione MXcell e Gene buffer di elettroporazione Pulser sono stati specificamente sviluppati per trasfettare acidi nucleici nelle cellule dei mammiferi e di difficile trasfezione delle cellule, come i video cells.This primarie e staminali dimostra come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino , e poi li preparano per l'elettroporazione nel sistema MXcell. Si comincia isolando femore e della tibia. Midollo osseo da femore e della tibia vengono poi raccolte e le culture sono stabiliti. Colture di cellule del midollo osseo sono poi transfettate e analizzati.
Protocol
La raccolta di midollo osseo da femori e tibie
- Il primo passo della procedura è quello di raccogliere midollo osseo dal femore e la tibia di un 6 - a 12 settimane vecchio mouse (stiamo usando topi BALB / c, ma si può fare questa procedura con qualsiasi ceppo di topi). Per iniziare, eutanasia il mouse da CO 2 inalazioni (non sarà mostrato). Vendemmia femore e tibia dalle zampe posteriori di ciascuno. Poi, con una lametta da barba, tagliare ogni estremità del femori per rimuovere l'anca e le articolazioni del ginocchio e per esporre il midollo.
- In modo simile, tagliare ogni estremità della tibia per rimuovere il ginocchio e della caviglia regioni limitrofe e per esporre il midollo.
- Fate una siringa da 3 ml con una 26-gauge e riempirlo con RPMI supplementato con 10% FBS, penicillina, streptomicina, e beta-mercaptoetanolo (BME = 100 uM). Utilizzando una pinzetta, tenere l'osso su una piastra di Petri contenente RPMI media. Inserire l'ago della siringa in una delle estremità delle ossa e premere lo stantuffo per scovare il midollo osseo. L'ago della siringa può essere spostato su e giù dentro l'osso per scovare midollo residuo.
- Ripetere la procedura per tutte le ossa, e quindi procedere con istituisce la culture.
Stabilire Culture
- Per stabilire le culture del midollo osseo, pipetta il midollo osseo lavata su e giù parecchie volte per rompere il tessuto in una sospensione cellulare.
- Collocare un filtro di 70 micron in cima ad un tubo 50 ml conica, e aggiungere la sospensione cellulare al filtro.
- Sciacquare la piastra Petri una volta con RPMI, quindi aggiungere il risciacquo del filtro per i 70 micron.
- Utilizzando la fine di gomma di una siringa da 1 ml stantuffo, macinare i pezzi rimanenti del midollo osseo nella parte superiore del filtro di 70 micron.
- Lavare il filtro una volta con RPMI.
- Dopo aver lavato il filtro, centrifuga la sospensione cellulare a 1200 rpm per 5 minuti.
- Lavare il pellet da risospendere in PBS.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Noi di solito ottenere ~ 90 milioni di cellule di ossa di un mouse (due femori e due tibie). Dopo il conteggio delle cellule, li centrifuga di nuovo a 1200 rpm per 5 minuti.
- Risospendere le celle di una piccola quantità di RPMI e le aliquote in fiasche colture di tessuti contenenti abbastanza RPMI in modo che l'concentrazione finale è di 1 milione di cellule per mL.
- Aggiungi citochine a promuovere lo sviluppo del vostro tipo di cellula di interesse. In questo caso, la citochina interleuchina-3 (IL-3 = 10 ng / mL) viene aggiunto per promuovere lo sviluppo dei basofili e mastociti. Per acquisire basofili, incubare per 10 giorni. Per i mastociti, incubare per 5 settimane. Quando si genera mastociti, i media e IL-3 dovrebbe essere cambiata una volta alla settimana.
- Ecco uno sguardo a come mastociti dovrebbe apparire subito dopo placcatura. Questa immagine mostra la differenziazione delle cellule del midollo dell'albero in basofili e mastociti 10 giorni dopo l'aggiunta di interleuchina-3.
- Una volta che il tipo cellulare desiderato si ottiene, procedere con il passaggio elettroporazione.
Cellule Electroporating
- Per iniziare il passo elettroporazione, determinare il numero di cellule nel pallone cultura.
- Le cellule sono in genere elettroporate ad una densità di 10 milioni per ml, in modo da trasferire il numero di cellule per tubi conici e centrifugare le provette a 1200 rpm per 5 minuti.
- Dopo la centrifugazione, aspirare i media, lavare le cellule con PBS 1X, e centrifugare di nuovo a 1200 rpm per 5 minuti.
- Aspirare il PBS e aggiungere Bio-Rad Gene buffer di elettroporazione Pulser per fare una sospensione di cellule di 10 milioni di cellule per ml.
- Dopo risospendere le cellule, aggiungere il DNA desiderato plasmide ad una concentrazione finale di 10 a 20 microgrammi per ml.
- Aliquota 150 microlitri di sospensione cellulare in pozzi di vostra scelta su un piatto elettroporazione 96-bene.
- Mettete la placca nella camera di elettroporazione MXcell piastra e chiudere il coperchio.
- Prima di trasfezione dei mastociti, un protocollo di elettroporazione deve essere programmato in MXcell a meno di utilizzare un protocollo predefinito o memorizzati. Attraverso esperimenti di ottimizzazione che hanno scoperto che la più alta efficienza di trasfezione dei mastociti avvenire utilizzando protocolli di piazza dell'onda di polso. Noi variare le condizioni elettroporazione sul piatto per fornire 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms e 350V/10ms impulsi a onda quadra 2000uF e 1000 ohm. Una volta che il protocollo è stato impostato e caricata sul dispositivo, premere il tasto "Pulse" per electroporate le cellule.
- Dopo l'elettroporazione è completa, trasferire le cellule a una piastra di coltura dei tessuti. Noi di solito trasferire ogni campione elettroporazione 150 microlitri di un pozzo in un 48-pozzetti di coltura contenente 300 microlitri RPMI (supplementato con 10% FCS, penicillina, streptomicina, e beta-mercaptoetanolo) con 10 nanogrammi per ml interleuchina-3. Le cellule vengono incubate overnight a 37 ° C, poi analizzati 24 ore più tardi per l'espressione e la soppressione.
Transfection Risultati
L'immagine di microscopia a fluorescenza delle cellule dopo l'elettroporazione di successo con 20 microgrammi per ml GFP plasmide viene mostrato nel video. Utilizzando il sistema di elettroporazione MXcell efficienze di trasfezione di circa il 30% può essere ottenuto. Il sistema consente di variare le condizioni per massimizzare l'efficienza di trasfezione, pur mantenendo la vitalità cellulare.
Discussion
Come più informazioni genomiche emerge e nuovi strumenti come siRNA sono sviluppati, l'uso di cellule fisiologicamente rilevanti è diventato sempre più importante per migliorare la nostra comprensione delle vie di malattia, interazioni proteina-proteina, e la trasduzione del segnale. Pile sono ottenute direttamente da tessuti o fluidi e coltivate in vitro. Queste cellule possono essere manipolati in vari modi, anche attraverso l'introduzione di materiale genetico esogeno. E 'sempre più evidente che il modo più efficace per introdurre DNA plasmidico o siRNA in cellule primarie è elettroporazione.
Elettroporazione espone le cellule a impulsi elettrici al fine di aumentare temporaneamente la permeabilità della membrana cellulare, consentendo in tal modo esogeno acidi nucleici per entrare nella cellula. Questo metodo di trasfezione può essere ottimizzato per accogliere le differenze tra diversi tipi di cellule / linee e, quindi, può essere utilizzato per trasfettare mastociti così come qualsiasi altro osso cellule derivate dal midollo. Inoltre, a differenza virale mediata trasfezione, elettroporazione non impone limiti alle dimensioni del DNA transfettate, né richiedono una preparazione. A differenza dei lipidi mediata trasfezione, elettroporazione può essere meno tossico e non dia luogo a cattura endosomiali degli acidi nucleici transfettate.
Bio-Rad ha sviluppato il sistema di elettroporazione MXcell appositamente per queste cellule. il MXcell consente di variare le condizioni per massimizzare l'efficienza di trasfezione e la vitalità cellulare. Al fine di ottimizzare l'efficienza di trasfezione e ridurre al minimo la morte delle cellule, una moltitudine di parametri tra cui elettroporazione tensione, capacità, resistenza e durata dell'impulso può essere regolata e valutati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
