Summary
הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג'ין מערכת MXCell electroporation.
Abstract
זה הופך ברור יותר ויותר כי electroporation היא הדרך היעילה ביותר להציג את ה-DNA או פלסמיד siRNA לתוך תאים ראשוניים. Pulser ג'ין מערכת MXcell electroporation וג'ין Pulser חיץ electroporation פותחו במיוחד כדי transfect חומצות גרעין לתאי יונקים קשות transfect תאים, כגון וידאו cells.This יסודי גזע מדגים כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ולאחר מכן להכין אותם electroporation במערכת MXcell. אנחנו מתחילים ידי בידוד עצם הירך לבין השוקה. מוח העצם של הירך והן השוקה נקצרים אז ותרבויות מבוססים. בתרבית תאים במח העצם הם transfected כך וניתח.
Protocol
קציר מוח העצם מן עצמות הירך לבין Tibiae
- השלב הראשון של ההליך הוא לקצור מח העצם של עצמות הירך לבין tibiae של 6 - עכבר 12 שבועות הישן (אנחנו משתמשים BALB / c עכברים אבל אתה יכול לעשות הליך זה עם זן כל העכבר). כדי להתחיל, להרדים את העכבר משאיפת CO 2 (לא יוצג). קציר עצם הירך לבין tibiae מן הרגליים האחוריות של כל אחד. ואז, עם סכין גילוח, לחתוך כל סוף עצמות הירך כדי להסיר את הירך והמפרקים הברך לחשוף את מח.
- באופן דומה, לחתוך כל סוף tibiae כדי להסיר את הברך ואזורים סמוכים הקרסול לחשוף את מח.
- קח מזרק 3 מ"ל עם מחט 26-מד ולמלא אותו RPMI FBS בתוספת 10%, פניצילין, סטרפטומיצין, ואת בטא mercaptoethanol (BME 100 = UM). בעזרת פינצטה, להחזיק את העצם מעל צלחת פטרי המכילה RPMI התקשורת. הכנס את מחט המזרק לתוך קצהו האחד של העצם, לוחץ על המתג כדי לשטוף את מוח העצם. מחט המזרק ניתן להזיז למעלה ולמטה בתוך העצם כדי לשטוף את מוח שיורית.
- חזור על התהליך עבור כל העצמות, ואז להמשיך עם הקמת תרבויות.
הקמת תרבויות
- כדי להקים את התרבויות מח עצם, פיפטה מח העצם סמוקות מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבור את הרקמה לתוך תא ההשעיה.
- מקום מסנן 70 מיקרון על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל, ומוסיפים את ההשעיה תא המסנן.
- יש לשטוף את צלחת פטרי פעם אחת עם RPMI, ואז מוסיפים את לשטוף את מסנן 70 מיקרון.
- שימוש בסוף גומי של 1 מ"ל במזרק הבוכנה, לטחון את חתיכות מוח העצם שנותרו על גבי פילטר 70 מיקרון.
- שטפו את המסנן פעם אחת עם RPMI.
- לאחר שטיפת מסנן, צנטריפוגה ההשעיה תא בסל"ד 1200 למשך 5 דקות.
- שטפו את תא גלולה ידי resuspending ב PBS.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer. אנחנו בדרך כלל להשיג ~ 90 מיליון תאים מהעצמות אחד העכבר (שתי עצמות הירך בתוספת שתי tibiae). לאחר ספירת תאים, צנטריפוגה אותם שוב בסל"ד 1200 למשך 5 דקות.
- Resuspend התאים כמות קטנה של RPMI ו aliquot אותם לתוך צלוחיות תרבות רקמה המכילה מספיק RPMI כך הריכוז הסופי הוא 1 מיליון תאים לכל מ"ל.
- הוסף ציטוקינים כדי לקדם את הפיתוח של סוג התא העניין שלך. במקרה זה, ציטוקינים interleukin-3 (IL-3 = 10 ng / mL) נוסף כדי לקדם את הפיתוח של בזופילים ותאי פיטום. כדי לרכוש בזופילים, דגירה 10 ימים. עבור תאים התורן, דגירה של 5 שבועות. בעת יצירת תא הפיטום, התקשורת IL-3 יש לשנות פעם בשבוע.
- הנה מבט על כמה תאים התורן אמור להופיע רק לאחר ציפוי. תמונה זו ממחישה את התמיינות של תאים במח התורן לתוך בזופילים ותאי תורן 10 ימים לאחר תוספת של interleukin-3.
- פעם את סוג התא הרצוי מתקבל, להמשיך לשלב electroporation.
Electroporating תאים
- כדי להתחיל את הצעד electroporation, לקבוע את מספר התאים בקבוק התרבות.
- תאים הם electroporated בדרך כלל צפיפות של 10 מיליון דולר מ"ל, כדי להעביר את המספר הסלולרי נדרש צינורות חרוטי ו צנטריפוגות צינורות ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות.
- לאחר centrifuging, לשאוב את התקשורת, לשטוף את התאים עם 1X PBS, ו צנטריפוגות שוב ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות.
- לשאוב PBS ולהוסיף Bio-Rad ג'ין חיץ Pulser electroporation לעשות השעיה תא של 10 מיליון תאים לכל מ"ל.
- לאחר resuspending את התאים, להוסיף את ה-DNA פלסמיד הרצוי בריכוז סופי של 10 עד 20 מיקרוגרם למ"ל.
- Aliquot 150 מיקרוליטר של השעיה התא לתוך בארות על פי בחירתך על צלחת electroporation 96-היטב.
- שים את צלחת electroporation בחדר צלחת MXcell ולסגור את המכסה.
- לפני transfection של תא הפיטום, פרוטוקול electroporation חייב להיות שתוכנת MXcell אלא באמצעות פרוטוקול מראש או מאוחסנים. באמצעות ניסויים אופטימיזציה גילינו את היעילות הגבוהה ביותר transfection של תא הפיטום להתרחש באמצעות מרובע פרוטוקולים גל הדופק. אנו ישתנו התנאים electroporation על הצלחת להעביר 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms ו 350V/10ms פולסים מרובע לנופף 2000uF אוהם ו 1000. לאחר פרוטוקול הוגדר ולטעון המכשיר, ללחוץ על "דופק" כדי electroporate התאים.
- לאחר electroporation תושלם, העברת תאים לצלחת בתרבית רקמה. אנחנו בדרך כלל העברת כל 150 electroporation מדגם microliter אל באר צלחת 48-היטב בתרבות רקמה המכילה 300 מיקרוליטר RPMI (בתוספת 10% FCS, פניצילין, סטרפטומיצין, ואת בטא mercaptoethanol) עם 10 ננוגרם למ"ל interleukin-3. תאים מודגרת לילה בשעה 37 ° C, אז assayed 24 שעות מאוחר יותר לביטוי ודיכוי.
טראןsfection תוצאות
תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים לאחר electroporation מוצלח באמצעות 20 מיקרוגרם למ"ל GFP פלסמיד מוצג הווידאו. שימוש במערכת electroporation MXcell transfection יעילות של כ -30% ניתן להשיג. המערכת מאפשרת לך להשתנות התנאים כדי למקסם את היעילות transfection שלך, תוך שמירה על כדאיות התא.
Discussion
כאשר מידע גנטי יותר עולה וכלים חדשים כגון siRNA מפותחים, השימוש פיזיולוגית התאים הרלוונטיים הפך חשוב יותר מתמיד כדי לקדם את ההבנה שלנו של המסלולים המחלה, חלבונים אינטראקציות, ואת הולכת אותות. תאים ראשוניים מתקבלים ישירות לרקמות או נוזלים מעובד במבחנה. תאים אלה ניתן לטפל במספר דרכים, כולל באמצעות הקדמה של חומר גנטי חיצוני. זה הופך ברור יותר ויותר כי הדרך היעילה ביותר להציג את ה-DNA או פלסמיד siRNA לתוך תאים ראשוניים הוא electroporation.
Electroporation חושף תאים פולסים חשמליים על מנת transiently להגדיל את החדירות של קרום התא, ובכך לאפשר חומצות גרעין אקסוגניים להיכנס לתא. שיטה זו של transfection יכול להיות מותאם כדי להכיל את ההבדלים בין תאים מסוגים שונים / קווי, ולכן ניתן להשתמש בו כדי transfect תא הפיטום וכן כל מח עצם אחרות הנגזרות התא. יתר על כן, בניגוד transfection ויראלי בתיווך, electroporation אינה מטילה מגבלות על גודל של ה-DNA transfected, ולא דורשים הכנה נרחבת. בניגוד transfection השומנים בתיווך, electroporation יכול להיות פחות רעיל ואינו לגרום השמנה endosomal של חומצת גרעין transfected.
ביו רד פיתחה את מערכת electroporation MXcell במיוחד עבור תאים אלה. MXcell מאפשר לך להשתנות התנאים כדי למקסם את היעילות ואת הכדאיות transfection התא. כדי לייעל את נצילות transfection ולמזער מוות של תאים, מספר רב של פרמטרים electroporation כולל מתח, קיבול, התנגדות, אורך הפולס יכול להיות מותאם ומוערכת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
