Summary
Este procedimento descreve como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos e é seguido por transfecção usando o Gene Pulser sistema de eletroporação MXCell.
Abstract
É cada vez mais evidente que eletroporação é a forma mais eficaz para introduzir DNA plasmídeo ou siRNA em células primárias. O Gene Pulser sistema de eletroporação MXcell e Gene tampão de eletroporação Pulser foram desenvolvidos especificamente para transfecção ácidos nucleicos em células de mamíferos e de difícil transfecção de células, tais como vídeo primário e cells.This-tronco demonstra como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos , e depois prepará-los para eletroporação no sistema MXcell. Começamos isolando fêmur e tíbia. Medula óssea de ambos os fêmur ea tíbia são, então, colhidas e culturas são estabelecidas. Células da medula óssea cultivadas são, então, transfectadas e analisados.
Protocol
A colheita de medula óssea de fêmures e tíbias
- O primeiro passo do procedimento é a colheita de medula óssea de fêmures e tíbias o de um 6 - a 12 semanas de mouse antigo (que estamos usando camundongos BALB / c, mas você pode fazer este procedimento com qualquer tensão mouse). Para começar, euthanize o mouse por inalação de CO 2 (não irá ser exibido). Fêmur e tíbia colheita das pernas traseiras de cada um. Então, com uma lâmina de barbear, cortar cada extremidade do fémur para remover o quadril e joelho e para expor a medula.
- De forma semelhante, corte cada extremidade da tíbia para remover o joelho eo tornozelo regiões adjacentes e para expor a medula.
- Pegue uma seringa de 3 mL com uma agulha de calibre 26 e preenchê-lo com RPMI suplementado com SFB 10%, penicilina, estreptomicina e beta-mercaptoetanol (BME = 100 uM). Usando uma pinça, segure o osso por uma placa de Petri contendo RPMI mídia. Inserir a agulha da seringa em uma das extremidades do osso e pressionar o êmbolo para expulsar da medula óssea. A agulha da seringa pode ser movida para cima e para baixo dentro do osso para expulsar medula residual.
- Repita o procedimento para todos os ossos, e então proceder com o estabelecimento das culturas.
Estabelecer culturas
- Para estabelecer as culturas de medula óssea, pipetar a medula óssea vermelha para cima e para baixo várias vezes para quebrar o tecido em uma suspensão de células.
- Colocar um filtro de 70 micron em cima de um tubo cônico de 50 mL, e adicione a suspensão de células para o filtro.
- Lavar a placa de Petri uma vez com RPMI, em seguida, adicione a água para o filtro 70 mícron.
- Usando o final de borracha de uma seringa de 1 mL êmbolo, moer os pedaços restantes de medula óssea na parte superior do filtro micron 70.
- Lavar o filtro com um tempo RPMI.
- Depois de lavar o filtro, centrifugar a suspensão celular a 1200 rpm por 5 minutos.
- Lave o pellet celular pela ressuspensão em PBS.
- Contar as células usando um hemocitômetro. Normalmente, obter a 90 milhões de células de ossos um rato (dois fêmures e duas tíbias). Após a contagem das células, centrifugar novamente a 1200 rpm por 5 minutos.
- Ressuspender as células em uma pequena quantidade de RPMI e alíquota-los em frascos de cultura de tecidos contendo RPMI suficiente para que a concentração final é de 1 milhão de células por ml.
- Adicionar citocinas para promover o desenvolvimento do seu tipo de célula de interesse. Neste caso, a citocina interleucina-3 (IL-3 = 10 ng / mL) é adicionado para promover o desenvolvimento de basófilos e mastócitos. Para adquirir basófilos, incubar por 10 dias. Para mastócitos, incubar por 5 semanas. Ao gerar mastócitos, a mídia e IL-3 deve ser trocada uma vez por semana.
- Aqui está uma olhada em como mastócitos deve aparecer apenas após o plaqueamento. Esta imagem demonstra a diferenciação de células da medula mastro em basófilos e mastócitos 10 dias após a adição de interleucina-3.
- Uma vez que o tipo de célula desejada é obtida, prossiga com o passo eletroporação.
Células Electroporating
- Para começar a etapa de eletroporação, determinar o número de células no frasco de cultura.
- As células são tipicamente electroporated a uma densidade de 10 milhões por mL, então transferir o número de células necessárias para tubos cônicos e centrifugar os tubos a 1200 rpm por 5 minutos.
- Após a centrifugação, aspirar a mídia, lavar as células com PBS 1X, e centrifugar novamente a 1200 rpm por 5 minutos.
- Aspirar o PBS e adicionar Bio-Rad Gene tampão de eletroporação Pulser para fazer uma suspensão de células de 10 milhões de células por mL.
- Depois de ressuspender as células, adicionar o DNA desejado plasmídeo em uma concentração final de 10 a 20 microgramas por mL.
- Alíquota de 150 microlitros da suspensão de células em poços de sua escolha em uma placa de eletroporação de 96 poços.
- Coloque a placa na câmara de eletroporação placa MXcell e feche a tampa.
- Antes de transfecção de mastócitos, um protocolo de eletroporação deve ser programado no MXcell menos usando um protocolo preestabelecido ou armazenados. Através de experimentos de otimização descobrimos que a mais alta eficiência de transfecção de mastócitos ocorrem usando protocolos de pulso de onda quadrada. Vamos alterar as condições de eletroporação na placa para entregar 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms, e pulsos de onda quadrada na 350V/10ms 2000uF e 1000 ohms. Uma vez que o protocolo foi definido e carregado para o dispositivo, pressione "Pulse" para electroporate as células.
- Depois de eletroporação é completo, a transferência das células para uma placa de cultura de tecidos. Normalmente, a transferência de cada amostra de 150 microlitros eletroporação a um poço em uma placa de cultura de 48 poços contendo 300 microlitros tecido RPMI (suplementado com 10% FCS, penicilina, estreptomicina e beta-mercaptoetanol) com 10 nanogramas por ml de interleucina-3. As células são incubadas overnight a 37 ° C, em seguida, analisadas 24 horas depois de expressão e supressão.
TranResultados sfection
A imagem de microscopia fluorescente das células após a eletroporação bem sucedido usando 20 microgramas por mL GFP plasmídeo é mostrado no vídeo. Usando o eletroporação MXcell a eficácia do sistema de transfecção de cerca de 30% pode ser obtida. O sistema permite variar as condições para maximizar a eficiência de transfecção, mantendo a viabilidade das células.
Discussion
À medida que mais informação genômica emerge e novas ferramentas, como siRNA são desenvolvidos, o uso de células fisiologicamente relevante se tornar cada vez mais importante para promover nossa compreensão das vias de doença, interações proteína-proteína, e transdução de sinal. As células primárias são obtidas diretamente a partir de tecidos ou fluidos e cultivadas in vitro. Estas células podem ser manipuladas em uma série de maneiras, incluindo através da introdução de material genético exógeno. É cada vez mais evidente que a maneira mais eficaz para introduzir DNA plasmídeo ou siRNA em células primário é eletroporação.
Eletroporação expõe as células a pulsos elétricos, a fim de aumentar a permeabilidade transitória da membrana celular, permitindo assim exógenos ácidos nucléicos para entrar na célula. Este método de transfecção pode ser otimizada para acomodar as diferenças entre os diferentes tipos de células / linhas e, portanto, pode ser usado para transfecção mastócitos, bem como de qualquer outro osso de células derivadas da medula. Além disso, ao contrário viral mediada transfecção, eletroporação não impõe limites no tamanho do DNA transfectado, nem requerem uma preparação extensiva. Em contraste com lipídica mediada por transfecção, eletroporação pode ser menos tóxico e não resultar em aprisionamento endossomal do ácido nucléico transfectadas.
Bio-Rad foi desenvolvido o sistema de eletroporação MXcell especificamente para estas células. o MXcell permite variar as condições para maximizar sua eficiência de transfecção e viabilidade celular. A fim de otimizar a eficiência de transfecção e minimizar a morte celular, uma multiplicidade de parâmetros eletroporação incluindo tensão, capacitância, resistência e comprimento do pulso pode ser ajustada e avaliados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
