Summary
Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.
Abstract
Het wordt steeds duidelijker dat elektroporatie is de meest effectieve manier om plasmide DNA of siRNA introduceren in primaire cellen. De Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem en Gene Puiser elektroporatie buffer zijn speciaal ontwikkeld om nucleïnezuren te transfecteren in zoogdiercellen en moeilijk te transfecteren cellen, zoals de primaire en stam cells.This video laat zien hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf muizen beenmerg , en vervolgens hen voor te bereiden elektroporatie in het MXcell systeem. We beginnen met het isoleren van dijbeen en scheenbeen. Beenmerg van zowel de femur en de tibia worden dan geoogst en culturen zijn gevestigd. Gekweekte beenmergcellen worden vervolgens getransfecteerd en geanalyseerd.
Protocol
Oogsten beenmerg van bovenbenen en tibiae
- De eerste stap van de procedure is om beenmerg oogst van de bovenbenen en de tibiae van een 6 - tot 12-week oude muis (we gebruiken BALB / c muizen, maar u kunt deze procedure doen met een muis-stam). Om te beginnen, euthanaseren de muis door CO 2 inhalatie (wordt niet getoond). Oogst dijbeen en tibiae van de achterpoten van elk. Dan, met een scheermesje, snij elk uiteinde van het dijbeen aan de heup-en kniegewrichten te verwijderen en het merg bloot te leggen.
- Op een vergelijkbare manier, snijd elk uiteinde van de tibiae aan de knie en de enkel aangrenzende regio's te verwijderen en het merg bloot te leggen.
- Neem een 3 ml spuit met een 26-gauge naald en vul deze met RPMI aangevuld met 10% FBS, penicilline, streptomycine, en beta-mercapto-ethanol (BME = 100 uM). Met een pincet, houdt het bot over een petrischaal met RPMI media. Steek de naald in het ene uiteinde van het bot en de zuiger uit te spoelen het beenmerg. De naald kan worden verplaatst op en neer in het bot uit te spoelen resterende beenmerg.
- Herhaal de procedure voor alle beenderen, en ga dan verder met het vaststellen van de culturen.
Tot vaststelling van culturen
- Om vast te stellen het beenmerg culturen, pipet de gespoeld beenmerg op en neer een paar keer op te breken het weefsel in een cel suspensie.
- Plaats een 70 micron filter op de top van een 50 ml conische buis, en voeg de celsuspensie om het filter.
- Spoel de petrischaal een keer met RPMI, voeg dan de spoel aan de 70 micron filter.
- Met behulp van de rubber einde van een 1 ml zuiger, slijpen het beenmerg stukken blijven op de top van de 70 micron filter.
- Was het filter een keer met RPMI.
- Na het wassen van de filter, centrifuge de celsuspensie bij 1200 rpm gedurende 5 minuten.
- Was de celpellet door resuspenderen in PBS.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. We meestal krijgen ~ 90 miljoen cellen van de botten een muis (twee dijbeen plus twee tibiae). Na het tellen van de cellen, opnieuw centrifuge ze bij 1200 rpm gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de cellen in een kleine hoeveelheid RPMI en aliquot ze in weefselkweek kolven met genoeg RPMI, zodat de uiteindelijke concentratie is 1 miljoen cellen per ml.
- Voeg cytokinen aan de ontwikkeling van uw celtype van belang te bevorderen. In dit geval is het cytokine interleukine-3 (IL-3 = 10 ng / mL) toegevoegd aan de ontwikkeling van basofielen en mestcellen te bevorderen. Te verwerven basofielen, incubeer gedurende 10 dagen. Voor de mestcellen, incubeer gedurende 5 weken. Bij het genereren van mestcellen, de media en IL-3 moet een keer een week worden gewijzigd.
- Hier is een blik op hoe de mestcellen moeten verschijnen vlak na plating. Deze afbeelding toont de differentiatie van beenmergcellen in de mast basofielen en mestcellen 10 dagen na de toevoeging van interleukine-3.
- Zodra het gewenste celtype is verkregen, gaan met de elektroporatie stap.
Electroporating Cellen
- Om te beginnen de elektroporatie stap, bepalen het aantal cellen in de cultuur kolf.
- Cellen zijn meestal geëlektroporeerd bij een dichtheid van 10 miljoen per ml, zodat overdracht van de benodigde cel nummer conische buizen en centrifugeer de buizen op 1200 rpm gedurende 5 minuten.
- Na centrifugeren, aspiratie van de media, was de cellen met 1X PBS, en centrifugeer opnieuw bij 1200 rpm gedurende 5 minuten.
- Zuig het PBS en voeg Bio-Rad Gene Puiser elektroporatie buffer om een celsuspensie van 10 miljoen cellen per ml.
- Na resuspenderen van de cellen, voeg de gewenste plasmide-DNA bij een uiteindelijke concentratie van 10 tot 20 microgram per ml.
- Aliquot 150 microliter van de celsuspensie in putten van uw keuze op een 96-well plaat elektroporatie.
- Zet de plaat in de elektroporatie MXcell plaat kamer en sluit het deksel.
- Voorafgaand aan de transfectie van mestcellen, moet een elektroporatie protocol worden geprogrammeerd in de MXcell, tenzij met behulp van een vooraf ingestelde of opgeslagen protocol. Door optimalisatie experimenten hebben we ontdekt dat de hoogste transfectie efficiëntie van mestcellen komen blokgolf-protocollen gebruikt. We zullen variëren de elektroporatie voorwaarden op de plaat te 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms en 350V/10ms blokgolf pulsen leveren aan 2000uF en 1000 ohm. Nadat het protocol is ingesteld en geladen op het apparaat, drukt u op "Pulse" om de cellen te electroporate.
- Na de elektroporatie is voltooid, overdracht van de cellen om een weefselkweek plaat. We meestal breng elke 150 microliter elektroporatie monster op een goed in een 48-well weefselkweek plaat met 300 microliter RPMI (aangevuld met 10% FCS, penicilline, streptomycine, en beta-mercapto-ethanol) met 10 nanogram per ml interleukine-3. Cellen worden gedurende de nacht geïncubeerd bij 37 ° C, vervolgens getest 24 uur later voor expressie en onderdrukking.
Transfection resultaten
De fluorescentie microscopie beeld van de cellen na succesvolle elektroporatie gebruik van 20 microgram per ml GFP plasmide wordt getoond in de video. Met behulp van de MXcell elektroporatie systeem transfectie efficiëntie van ongeveer 30% kan worden verkregen. Het systeem stelt u in staat om voorwaarden om uw transfectie-efficiëntie te maximaliseren variëren, met behoud van levensvatbaarheid van de cellen.
Discussion
Naarmate meer genomische informatie naar voren komt en nieuwe tools zoals siRNA worden ontwikkeld, is het gebruik van fysiologisch relevante cellen worden steeds belangrijker voor ons begrip van de ziekte wegen, eiwit-eiwit interacties, en signaaltransductie verder. Primaire cellen worden rechtstreeks verkregen uit weefsels of vloeistoffen en gekweekt in vitro. Deze cellen kunnen worden gemanipuleerd in een aantal manieren, onder meer door de introductie van exogeen genetisch materiaal. Het wordt steeds duidelijker dat de meest effectieve manier om plasmide DNA of siRNA te introduceren in primaire cellen is elektroporatie.
Elektroporatie blootstelt cellen elektrische pulsen om tijdelijk verhoging van de permeabiliteit van de celmembraan, waardoor exogene nucleïnezuren naar de cel in te voeren. Deze methode van transfectie kunnen worden geoptimaliseerd om ruimte maken voor verschillen tussen de verschillende celtypen / lijnen en dus kunnen worden gebruikt om mestcellen transfecteren evenals alle andere beenmerg-afgeleide cel. Bovendien, in tegenstelling tot virale-gemedieerde transfectie, is elektroporatie niet beperkingen aan de grootte van de getransfecteerde DNA, noch een grondige voorbereiding. In tegenstelling tot de lipide-gemedieerde transfectie, kan electroporatie minder giftig en niet leidt tot endosomale vangen van de getransfecteerde nucleïnezuur.
Bio-Rad ontwikkelde de MXcell elektroporatie systeem speciaal voor deze cellen. de MXcell kunt u voorwaarden verschillen naar uw transfectie-efficiëntie en de levensvatbaarheid van de cellen te maximaliseren. Om de transfectie-efficiëntie te optimaliseren en het minimaliseren van celdood, een veelheid van elektroporatie parameters zoals spanning, kan capaciteit, weerstand en pulslengte worden aangepast en geëvalueerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
