Summary
Este procedimiento se describe cómo establecer cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina y es seguida por la transfección utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXCell.
Abstract
Cada vez es más evidente que la electroporación es la forma más eficaz para introducir ADN plásmido o siRNA en células primarias. El sistema de electroporación Gene Emisores MXcell y Gene tampón de electroporación Emisor se han desarrollado específicamente para transfectar ácidos nucleicos en células de mamíferos y difíciles de transfectar células, como el vídeo cells.This primaria y madre muestra cómo establecer cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina , y luego a prepararse para la electroporación en el sistema de MXcell. Comenzamos por el aislamiento del fémur y la tibia. La médula ósea de ambos fémur y la tibia se recolectan y las culturas establecidas. Cultivos de células de médula ósea son entonces transfectadas y analizados.
Protocol
La recolección de médula ósea de fémures y tibias
- El primer paso del procedimiento consiste en la cosecha de médula ósea de los fémures y tibias de un 6 - a la del ratón de 12 semanas de edad (estamos utilizando ratones Balb / c, pero que puede hacer este procedimiento con cualquier cepa de ratón). Para empezar, la eutanasia el ratón por inhalación de CO 2 (no se mostrará). Fémur y la tibia de la cosecha de las patas traseras de cada uno. Luego, con una cuchilla de afeitar, cortar los extremos del fémur para eliminar la cadera y la rodilla y para exponer la médula ósea.
- De manera similar, cortar los extremos de la tibia para eliminar la rodilla y el tobillo y las regiones adyacentes para exponer la médula ósea.
- Tome una jeringa de 3 ml con una aguja de calibre 26 y lo rellenamos con RPMI suplementado con FBS al 10%, penicilina, estreptomicina, y beta-mercaptoetanol (BME = 100 um). Con unas pinzas, sostener el hueso en una placa de Petri que contiene RPMI medios de comunicación. Inserte la aguja de la jeringa en un extremo del hueso y el émbolo para eliminar la médula ósea. La aguja de la jeringa se puede mover arriba y abajo dentro del hueso para eliminar la médula ósea residual.
- Repita el procedimiento con todos los huesos, y luego proceder con el establecimiento de los cultivos.
El establecimiento de las Culturas
- Para establecer los cultivos de médula ósea, una pipeta de la médula ósea lavado de arriba a abajo varias veces para romper el tejido en una suspensión de células.
- Colocar un filtro de 70 micras en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml, y añadir la suspensión celular en el filtro.
- Enjuague la placa de Petri una vez con RPMI, a continuación, agregar el enjuague de los 70 filtros de micrón.
- Con el extremo de caucho de un émbolo de una jeringa ml, moler las piezas restantes de médula ósea en la parte superior del filtro de 70 micras.
- Lave el filtro una vez con RPMI.
- Después de haberlo lavado, centrifugar la suspensión celular a 1200 rpm durante 5 minutos.
- Lavar el precipitado celular mediante resuspensión en PBS.
- Contar las células utilizando un hemocitómetro. Por lo general obtener ~ 90 millones de células de los huesos de un ratón (dos fémures más tibias dos). Después de contar las células, que centrifuga de nuevo a 1200 rpm durante 5 minutos.
- Resuspender las células en una pequeña cantidad de RPMI y alícuota en los frascos de cultivo de tejido que contiene suficiente RPMI para que la concentración final es de 1 millón de células por ml.
- Añadir citoquinas para promover el desarrollo de su tipo de célula de interés. En este caso, la citoquina interleuquina-3 (IL-3 = 10 ng / mL) para promover el desarrollo de los basófilos y mastocitos. Para adquirir los basófilos, incubar durante 10 días. De los mastocitos, se incuba durante 5 semanas. Cuando la generación de los mastocitos, los medios de comunicación e IL-3 se debe cambiar una vez por semana.
- Aquí está una mirada a cómo las células del mástil debe aparecer justo después de la siembra. La imagen muestra la diferenciación de las células de la médula mástil en los basófilos y mastocitos 10 días después de la adición de la interleucina-3.
- Una vez que el tipo celular deseado, proceda con el paso de la electroporación.
Las células Electroporating
- Para comenzar la etapa de la electroporación, determinar el número de células en el frasco de cultivo.
- Las células son típicamente electroporated a una densidad de 10 millones por ml, por lo que la transferencia del número de células necesarias para tubos cónicos y centrifugar los tubos a 1200 rpm durante 5 minutos.
- Después de centrifugar, aspirar los medios de comunicación, se lavan las células con PBS 1X, y centrifugar nuevamente a 1200 rpm durante 5 minutos.
- Aspirar el PBS y añadir Bio-Rad Gene tampón de electroporación generador de impulsos para hacer una suspensión celular de 10 millones de células por ml.
- Después de la resuspensión de las células, agregar el ADN del plásmido deseado a una concentración final de 10 a 20 microgramos por mL.
- Alícuota de 150 microlitros de la suspensión de células en los pozos de su elección en una placa de electroporación de 96 pozos.
- Coloque la placa de electroporación en la cámara de placa MXcell y cierre la tapa.
- Antes de la transfección de células cebadas, un protocolo de electroporación debe ser programado en el MXcell a menos que use un protocolo preestablecido o almacenados. A través de experimentos de optimización que hemos descubierto que la mayor eficiencia de la transfección de células cebadas se producen utilizando los protocolos de la onda de pulso cuadrado. Vamos a variar las condiciones de electroporación en la placa para entregar 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms y 350V/10ms pulsos de onda cuadrada a 2000uF y 1000 ohmios. Una vez que el protocolo se ha establecido y se cargan en el dispositivo, pulse "Pulse" para electroporar las células.
- Después de la electroporación es completa, la transferencia de las células en una placa de cultivo de tejidos. Por lo general la transferencia de cada muestra de 150 microlitros de electroporación de un pozo en una placa de tejido de 48 pocillos con 300 microlitros RPMI (complementado con un 10% de FCS, penicilina, estreptomicina, y beta-mercaptoetanol) a 10 nanogramos por mililitro de interleucina-3. Las células se incubaron durante la noche a 37 ° C, y luego analizaron 24 horas después de la expresión y la represión.
TranResultados sfection
La imagen de microscopía de fluorescencia de las células después de la electroporación con éxito utilizando los 20 microgramos por mL plásmido GFP se muestra en el video. Utilizando la electroporación MXcell eficiencia de transfección del sistema de alrededor del 30% se puede obtener. El sistema permite variar las condiciones para maximizar la eficiencia de transfección, mientras que el mantenimiento de la viabilidad celular.
Discussion
A medida que más información sobre el genoma surge y nuevas herramientas como siRNA desarrollados, el uso de células fisiológicamente relevantes se ha convertido cada vez más importante para mejorar nuestra comprensión de los caminos de la enfermedad, las interacciones proteína-proteína, y la transducción de señales. Las células primarias se obtienen directamente de los tejidos o fluidos y cultivadas in vitro. Estas células se pueden manipular de muchas maneras, incluso mediante la introducción de material genético exógeno. Cada vez es más evidente que la forma más eficaz para introducir ADN plásmido o siRNA en las células primarias es la electroporación.
Electroporación expone las células a pulsos eléctricos con el fin de aumentar de forma transitoria la permeabilidad de la membrana celular, permitiendo así que los ácidos nucleicos exógenos a entrar en la célula. Este método de transfección se puede optimizar para dar cabida a las diferencias entre los tipos de células diferentes / líneas y, por tanto, puede ser usado para transfectar las células cebadas, así como cualquier otro hueso derivadas de la médula de la célula. Además, a diferencia viral mediada por transfección, electroporación no impone límites en el tamaño de ADN transfectadas, ni requieren una preparación. A diferencia de los lípidos mediada por transfección, electroporación puede ser menos tóxico y no resulta en la captura endosomal del ácido nucleico transfectadas.
Bio-Rad ha desarrollado el sistema de electroporación MXcell específicamente para estas células. la MXcell le permite variar las condiciones para maximizar su eficiencia de transfección y viabilidad de las células. Con el fin de optimizar la eficiencia de transfección y reducir al mínimo la muerte celular, una multitud de parámetros de electroporación, incluyendo voltaje, capacidad, resistencia y duración del impulso se puede ajustar y evaluar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
