Summary
이 절차는 murine 골수에서 조혈 세포 기본 문화를 확립하고 진 Pulser MXCell의 electroporation 시스템을 사용 transfection하여 다음 방법을 설명합니다.
Abstract
그것은 electroporation은 기본 세포에 플라스미드 DNA 또는 siRNA을 소개하는 가장 효과적인 방법임을 더욱 분명 해지고 있습니다. 진 Pulser MXcell의 electroporation 시스템과 진 Pulser의 electroporation 버퍼가 특히 포유 동물 세포와 같은 기본 및 줄기 cells.This 비디오와 같은 어려운 transfect 세포로 핵산을 transfect하기 위해 개발되었습니다 것은 murine 골수에서 기본 조혈 세포 문화를 확립하는 방법을 보여줍니다 다음 MXcell 시스템의 electroporation을 위해 그들을 준비합니다. 우리는 대퇴골과 경골을 분리하여 시작합니다. 대퇴골과 경골 모두에서 골수 그런 다음 수확하고 문화가 설립됩니다. 교양 골수 세포는 다음 transfected 및 분석입니다.
Protocol
대퇴골과 Tibiae에서 골수 수확
- 12 주 된 마우스 (우리가 BALB / C 마우스를 사용하고 있지만 어떤 마우스 변형이 절차를 할 수있는)에 - 절차의 첫 단계는 6의 대퇴골과 tibiae에서 골수를 수확하는 것입니다. 시작하려면, CO 2 흡입 (표시되지 않습니다)로 마우스를 안락사. 각각의 뒷다리에서 수확 대퇴골과 tibiae. 그런 다음, 면도날과 고관절 및 무릎 관절을 제거하는 대퇴골의 각 끝을 잘라 골수를 노출합니다.
- 비슷한 방식으로, 무릎 및 발목 인접 지역을 제거하고 골수를 노출 tibiae의 각 끝을 잘라.
- 26 게이지 바늘로 3 ML의 주사기를 가지고 RPMI 10 % FBS, 페니실린, 스트렙토 마이신과 베타 - 메르 캅 토 에탄올 (BME = 100 음)와 보충으로 채우십시오. 핀셋을 사용하여 RPMI 미디어를 포함하는 페트리 접시 위에 뼈가시오. 뼈의 한쪽 끝을로 주사기 바늘을 삽입하여 골수를 제거하는 플런저를 우울. 주사기 바늘은 잔류 골수를 제거하는 뼈 내부 위아래로 이동할 수 있습니다.
- 문화를 확립을 진행 후 모든 뼈에 대해 절차를 반복합니다.
문화 구축
- 골수 문화를 구축하기 위해 세포 현탁액으로 조직을 해산시키기 위해 여러 번 다운 플러시 골수를 피펫합니다.
- 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 70 미크론 필터를 삽입하고, 필터에 세포 현탁액을 추가합니다.
- 페트리 접시에게 RPMI 한 시간을 씻어 후 70 미크론 필터로 헹굼 추가합니다.
- 1 ML 주사기 플런저의 고무 엔드를 사용하여 70 미크론 필터 위에 남아있는 골수 조각을 갈아서.
- RPMI과 필터를 한 번 씻으십시오.
- 필터를 세척 후 5 분 1,200 RPM의 세포 현탁액을 원심 분리기.
- PBS에서 resuspending하여 세포 펠렛을 씻으십시오.
- hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 우리는 일반적으로 마우스를 한번의 유골 (두 대퇴골 두 개의 tibiae)에서 ~ 90000000 세포를 구하십시오. 세포를 계산하면 5 분 동안 1,200 rpm으로 그들을 다시 원심 분리기.
- RPMI 및 나누어지는 그 때문에 최종 농도가 ML 당 백만 세포는 충분한 RPMI를 포함하는 조직 문화 flasks에 소량의 세포를 Resuspend.
- 관심의 세포 유형의 개발을 촉진하기 크린 시토킨를 추가합니다. 이 경우 시토킨 인터루킨 - 3 (IL - 3 = 10 NG / ML)은 basophils과 마스트 세포의 발전을 촉진하기 위해 추가됩니다. basophils를 얻기위한 10 일 동안 알을 품다. 돛대 세포의 경우, 5 주 동안 알을 품다. 돛대 세포를 생성할 때, 미디어와 IL - 3는 일주일에 한 번씩 변경해야합니다.
- 여기 마스트 세포가 단지 도금 후 나타나는 방법을 좀 봐입니다. 이 이미지는 10 일 인터루킨 - 3의 추가 후 basophils과 마스트 세포로 마스트 골수 세포의 분화를 보여줍니다.
- 원하는 세포 유형이 취득하면, electroporation 단계로 진행하십시오.
Electroporating 셀
- electroporation 단계를 시작하려면 문화 플라스크에 세포의 수를 결정합니다.
- 세포는 일반적으로 ML 당 10 만명의 밀도에 electroporated되므로, 원뿔 튜브에 필요한 휴대폰 번호를 전송하고 5 분 1,200 RPM에서 튜브를 원심 분리기.
- centrifuging 후, 미디어를 대기음 1X PBS로 세포를 씻어, 5 분 동안 1,200 rpm으로 다시 원심 분리기.
- PBS를 기음과 ML 당 10,000,000 세포의 세포 현탁액을 만드는 바이오 래드 진 Pulser의 electroporation 버퍼를 추가합니다.
- 세포를 resuspending 후, ML 당 10-20 마이크로 그램의 최종 농도에서 원하는 플라스미드 DNA를 추가합니다.
- 96 - 웰 플레이트 electroporation에 선택의 우물에 세포 현탁액의 나누어지는 150 microliters.
- MXcell 플레이트 챔버의 electroporation 판을 넣고 뚜껑을 닫습니다.
- 돛대 세포의 transfection하기 전에, electroporation 프로토콜은 미리 또는 저장 프로토콜을 사용하지 않는 MXcell로 프로그래밍해야합니다. 최적화 실험을 통해 우리는 마스트 세포의 가장 높은 transfection 효율이 사각형 웨이브 펄스 프로토콜을 사용하여 발생하는 것을 발견했습니다. 우리는 2000uF 1000 ohms에서 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms 및 350V/10ms 스퀘어 웨이브 펄스를 제공하기 위해 접시에 electroporation 조건을 달라질 수 있습니다. 프로토콜 설정하고 장치에 로드된되면, 세포를 electroporate에 "펄스"를 누르십시오.
- electroporation가 완료되면, 조직 문화 접시에 세포를 전송합니다. 우리는 일반적으로 ML 인터루킨 - 3 당 10 나노 그램 300 microliters RPMI를 (10 % FCS, 페니실린, 스트렙토 마이신과 베타 - 메르 캅 토 에탄올과 보충)가 포함된 48 잘 조직 배양 플레이트에 잘 각 150 microliter의 electroporation 샘플을 전송할 수 있습니다. 전지는 37 하룻밤 incubated 아르 ° C, 그때 표현과 억제를 위해 24 시간 후에 assayed.
트랜sfection 결과
플라스미드 ML 당 20 마이크로 그램 GFP를 사용하여 성공적인 electroporation 후 세포의 형광 현미경 이미지는 동영상에 표시됩니다. 약 30 %의 MXcell의 electroporation 시스템 transfection 효율성을 사용하는 것은 얻을 수 있습니다. 이 시스템은 세포 생존을 유지하면서 당신이 당신의 transfection 효율을 극대화하기 위해 조건을 변경할 수 있습니다.
Discussion
더 많은 게놈 정보를 얻습니다 siRNA와 같은 새로운 도구를 개발로서, 생리학 관련 세포의 사용은 질병 경로, 단백질 - 단백질 상호 작용 및 신호 전달에 대한 우리의 이해를 심화하기 위해 점점 더 중요 해지고있다. 차 전지는 조직이나 체액에서 직접 얻은하고 체외에서 재배하고 있습니다. 이러한 세포는 외인성 유전 물질의 도입을 포함 방법의 숫자 조작하실 수 있습니다. 그것은 기본 세포에 플라스미드 DNA 또는 siRNA을 소개하는 가장 효과적인 방법은 electroporation 것을 점점 더 분명 해지고 있습니다.
Electroporation은 transiently 따라서 외인성 핵산은 세포를 입력할 수 있도록 세포막의 투과성을 증가하기 위해 전기 펄스로 세포를 제공합니다. transfection의이 방법은 다른 세포 유형 / 라인, 따라서, 돛대 세포를 transfect하는 데 사용할 수있는뿐만 아니라 다른 골수 - 유래 세포 사이의 차이에 대한 수용하도록 최적화할 수 있습니다. 또한, 바이러스 - 매개 transfection와는 달리, electroporation은 transfected DNA의 크기에 제한을 부과하거나 광범위한 준비가 필요하지 않습니다. 지질 - 중재 transfection 대조적으로, electroporation 덜 독성 수 있으며 transfected 핵산의 endosomal 트래핑 발생하지 않습니다.
바이오 래드는 이러한 세포를 위해 특별히 MXcell의 electroporation 시스템을 개발했습니다. MXcell 여러분 transfection의 효율성과 세포 생존을 최대화하기 위해 조건을 변경할 수 있습니다. transfection 효율을 최적화하고 세포 사망, 전압을 포함하여 electroporation 매개 변수의 다수를 최소화하기 위해, 정전 용량, 저항, 및 펄스 길이는 조정과 평가 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
