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Biomedical Engineering

腹部大動脈瘤の近赤外蛍光イメージング

Overview

出典:アービン・H・ソエプリアートナ1、ケルシー・A・ブレンス2、クレイグ・J・ゲーゲン1

1インディアナ州パデュー大学、ウェストラファイエット大学ウェルドンバイオメディカルエンジニアリングスクール

2インディアナ州ウェストラファイエット校パデュー大学生化学科

近赤外蛍光(NIRF)イメージングは、蛍光プローブを利用して組織の複雑な生体分子アセンブリを可視化するエキサイティングな光学技術です。NIRFイメージングは、疾患の非侵襲的イメージングのための従来のイメージング方法に対して多くの利点を有する。単一光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)や陽電子放射断層撮影(PET)とは異なり、NIRFイメージングは高速で高スループットであり、電離放射線を伴いません。さらに、工学的標的特異的および活性化可能な蛍光プローブの最近の発展は、NIRFに高い特異性と感度を提供し、癌および心血管疾患の研究において魅力的なモダリティとなっています。提示された手順は、NIRFイメージングの背後にある原理と、様々な疾患を研究するために、小動物の生体内およびex vivo実験を行う方法を実証するように設計されています。ここに示す具体例は、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2(MMP2)の活性化可能な蛍光プローブを用いて、腹部大動脈瘤(AAA)の2つの異なるげっ歯類モデルにおける取り込みを研究する。

Principles

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名前が示すように、NIRFイメージングは、650 nmから900 nmまでの最初の近赤外窓内の光を利用して、フォトンを組織に送り込みます。フォトンのエネルギーEは式1が特徴で、hはプランクの定数、cは真空中の光の速度、λは光の波長です。

Equation 1= Equation 2 (式 1)

蛍光色素と呼ばれる標的特異的蛍光分子は、通常、遺伝子工学を介して、またはイメージングの前に尾静脈注射を介して動物に導入される。これらの蛍光体は光子エネルギーを吸収し、これは分子のエネルギーを接地状態S0から不安定で励起状態S1'に上昇させる。S1'状態の不安定性のために、分子はその状態内で最も低い振動エネルギーレベルにリラックスし、熱の形でエネルギーを放出します。蛍光色素は、現在、緩和された励起状態S1で、次いで、特定の波長で発光する接地状態S0に戻る。熱の形でエネルギーの放散のために長い波長を有する放出された光は、蛍光イメージングシステムを使用して捕捉され、記録される。吸収スペクトルと発光スペクトルの基本的なシフトはストークスシフトと呼ばれ、励起光と発光光を区別できるため重要です。

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Procedure

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次の手順では、小動物から生体内およびex vivo NIRF画像を収集するために必要な詳細な手順を示します。

1.実験的なセットアップ

  1. 光ファイバ光源を光ファイバ光ガイドを使用して蛍光イメージングシステムに接続します。
  2. 実験に適した励起フィルタを選択します。励起フィルタは、サンプルに送達される光の波長を決定し、サンプルに導入された蛍光色素の励起スペクトルと一致するように選択する必要があります。
  3. 適切な放出フィルタを選択します。発光フィルタは、自己蛍光に起因する可能性のある望ましくないスペクトル成分をブロックし、蛍光体の発光スペクトルに一致するように選択する必要があります。

2. サンプル調製

  1. イン・ヴィヴォ
    1. 流量計ダイヤルで3〜4%の濃度でイソフルランを使用して誘導室内で動物を麻酔する。
    2. イメージング段階で固定された鼻コーンに動物を移し、1〜2%の濃度でアイソフルランを維持する。動物は通常短期間(>5分)しか画像化されず、体温が実質的に低下しないため、熱源は必要ありません。
    3. モーションアーティファクトを最小限に抑えるために、動物の足を固定します。脱毛クリームを塗ることによって、対象の領域から髪を削除します。
    4. 必要な最小領域に脱毛クリームを塗布します。30sの後、ガーゼパッドで拭き取り、エチルアルコール湿ったガーゼパッドでもう一度領域を拭き取り、脱毛クリームを完全に除去します。
    5. 角膜の乾燥を防ぐために眼に眼軟膏を塗布する。
    6. 活性化可能な蛍光分子プローブを動物に注入する。この特定のアプリケーションについて、MMP2活性化可能なプローブを尾静脈に静脈内に注入した。この時点で、マウスをイメージできます。続行するには、このプロトコルの「イメージの取り付け」に進みます。短い手順を通して定期的な呼吸のために動物を監視します。
  2. Ex Vivo
    1. 蛍光プローブの注入後、動物の安楽死のための2013 AVMAガイドラインに従って、人道的な方法で動物を安楽死させる。二酸化炭素(CO2)過剰摂取は、小動物を安楽死させる標準的な習慣である。
    2. 外科的に目的の組織または器官を抽出し、鉗子で余分な脂肪組織を慎重に除去する。
    3. リン酸緩衝生理食塩水で組織をすすいで残りの血液を除去し、サンプルをイメージング段階に直接置きます。

3. 画像取得

  1. 分子イメージングソフトウェアを開き、光ファイバ光源と蛍光イメージングシステムの両方をオンにします。
  2. 集録ウィンドウを開き、スタディに適した露出のタイプを指定します。利用可能な露出には、単一の画像をキャプチャするための標準露出、一定の時間間隔で一連の画像をキャプチャするTime Lapse Exposure、異なる露光時間で連続した露出をキャプチャするプログレッシブ露出などがあります。
  3. イルミネーション ソースとしてUV トランスイルミネーションを選択します。
  4. プレビューされた画像を参照として使用して、レンズの焦点、視野、およびキャプチャシステムチャンバー内のfストップ/絞りを調整して、サンプリングされた画質を最適化します。サンプルの露光時間と位置を調整します。
  5. プレビュー ウィンドウを閉じ、取得ウィンドウのすべてのパラメータがカメラとフィルタの設定と一致していることを確認します。
  6. [公開] をクリックして、イメージを取得して保存します。
  7. 標準的な分子イメージングソフトウェアは、通常、画像解析用の蛍光信号を定量化するためのさまざまな分析、測定、および画像補正ツールを提供します。
  8. イメージングセッションの最後に、サンプル/動物を取り外し、システムの電源を切り、イメージングステージを清掃してシステムへのダメージを最小限に抑えます。

近赤外蛍光イメージングは、蛍光プローブを利用して組織の複雑な生体分子アセンブリを可視化する光学技術です。NIRFとも呼ばれるこの非侵襲的イメージング技術は迅速であり、電離放射線を必要としません。

NIRFでは、蛍光プローブを小分子と共役させ、がんや心血管疾患の進行を研究するために、より高い特異性を得ることができます。それらは組織の深部に浸透する近赤外光によって興奮し、これらの標的分子の濃度を変える病気の組織から健康な組織を導き出すために使用され得る。

このビデオでは、近赤外蛍光イメージングの原理と、様々な疾患を研究するために小動物で生体内およびex vivo実験を行う方法を説明します。

その名の通り、近赤外蛍光イメージングは、650ナノメートルから900ナノメートルまでの最初の近赤外窓内の光を利用して、フォトンを組織に送り込みます。蛍光色素と呼ばれる標的特異的蛍光分子は、通常、イメージングの前に遺伝子工学または注射を通じて動物に導入される。

これらの蛍光体は、地上状態S0から不安定な励起状態S1素数に分子のエネルギーを上昇させる光子エネルギーを吸収する。この状態は不安定であるため、分子は励起状態の中で最も低い振動エネルギーレベルまで緩和し、熱の形でエネルギーを放出します。蛍光色素は、現在、緩和された励起状態S1で、次いで、特定の波長の光を放出して、地上状態に戻る。

この光は、分子が最も低い振動エネルギーレベルに緩和するにつれて熱の形で消散するエネルギーのために、もともと蛍光色素に導入された光よりも長い波長を有する。その後、発光した光を蛍光イメージングシステムを用いて捕捉・記録します。

蛍光体の吸収と発光スペクトルのグラフは、蛍光体がそれぞれ吸収して放出できる波長の範囲を示しています。この基本的なシフトは、ピーク吸収とピーク発光波長のナノメートルの差であり、ストークスシフトと呼ばれます。各蛍光色素には、発光光を励起光と区別し、NIRFなどのイメージング技術を可能にする明確なストークスシフトがあります。

近赤外蛍光イメージングの主な原理を見直した後、動物を調製して画像化するステップバイステップの手順を順を追って説明しましょう。

まず、光ファイバ光源を蛍光イメージングシステムに接続するために、光ファイバ光源を使用します。サンプルに導入する蛍光の励起スペクトルに一致する励起フィルタを選択し、正しい波長の光が送達されるようにします。

次に、自己蛍光に起因する可能性のある望ましくないスペクトル成分をブロックする蛍光性の発光スペクトルに一致するように適切な発光フィルタを選択します。

生体内イメージングの準備を開始するには、ノックダウンチャンバーで動物を麻酔するためにアイソフルランを使用します。イメージングステージで固定された鼻コーンに動物を移します。モーションアーティファクトを最小限に抑えるために、動物の足を固定します。目的の領域から髪を削除するには、脱毛クリームを適用します。次に、動物の目に眼科軟膏を塗布して、角膜が乾燥するのを防ぎます。

この後、活性化可能な蛍光分子プローブを動物に注入する。画像取得を開始するには、分子イメージングソフトウェアを開きます。光ファイバ光源と蛍光イメージングシステムの両方をオンにします。

次に、取得ウィンドウを開き、スタディに適した露出のタイプを指定します。利用可能な露出には、単一の画像をキャプチャするための標準的な露出、一定の時間間隔で一連の画像をキャプチャする時間経過露出、および異なる露光時間における連続した一連の露出をキャプチャするプログレッシブ露出が含まれます。

次に、イルミネーション ソースとして UV トランスイルミネーションを選択します。プレビューイメージを参照として使用して、キャプチャシステムチャンバーのフォーカス、視野、およびFストップを調整して、サンプリングされた画質を最適化します。必要に応じて、サンプルの露光時間と位置を調整します。その後、プレビュー ウィンドウを閉じます。集録ウィンドウのすべてのパラメータがカメラとフィルタの設定と一致していることを確認します。[公開] をクリックして、イメージを取得して保存します。

ex vivoイメージングを準備するために、蛍光プローブの注入に続いて動物を人道的な方法で安楽死させる。鉗子を使用して、慎重に余分な腹外脂肪を除去します。次に、目的の組織または器官を外科的に抽出する。リン酸緩衝生理食塩水中の組織をすすいで残りの血液を除去する。次に、サンプルをイメージングステージ上に直接配置します。

生体内イメージングについて説明したのと同じプロトコルに従ってex vivo組織を画像化する。完了したら、ステージからサンプルを削除します。システムの電源を切り、イメージングステージをクリーニングします。

近赤外線フィールド画像を取得するためのプロトコルが完成したので、これらのスキャンの結果を確認しましょう。

これらの代表的な画像では、活性化可能な蛍光プローブを尾静脈を介して全身的に注入し、マトリックスメタロプロテイナーゼまたはMMP2を可視化する。ここでは、アンジオテンシンIIの注入に続いて腹部大動脈瘤を発症したアポリポプロテイン-E欠損マウスの生体内NIRF画像を見る。小さな高信号スポットのほとんどは皮膚の自己蛍光によるものであるが、血管系は高い蛍光シグナルを有する管状構造として視覚的に提示する。

第2の代表的な画像は、2つの異なる動物モデルからの腹部大動脈瘤のNIRF画像を比較する。一つは、アンジオテンシンII注入アポリポプロテイン-E欠損マウスにおける上骨腹部大動脈瘤である。そして2つは、豚膵臓エラスターゼを注入したラットにおける不毛腹部大動脈瘤である。

それぞれにおいて、腹部大動脈の動脈瘤領域におけるMMP2活性の増加が見られます。過剰な蛍光プローブを濾過し、腎臓に蓄積し、そこで観察される明るい蛍光シグナルを説明する。

次に、近赤外線フィールドイメージングの他のいくつかのアプリケーションを見てみましょう。まず、NIRFイメージングは、マウスモデルにおける心血管疾患の研究に用いることができる。

本研究では、ノックアウトマウスに2つの異なる近赤外蛍光プローブを注入する。大小田は24時間後に採取され、NIRFイメージングを介して評価される。結果は、有意なNIRF応答を示し、マクロファージ蓄積と共に位置する広範な石灰化の存在を示す。

NIRFイメージングは、生体内の腫瘍を見つけて評価するためにも使用できます。本研究では、蛍光腫瘍を模擬包含する乳房ファントムをシミュレートする組織が作成される。乳房保全手術中のNIRFイメージングの応用をシミュレートします。

その結果、腫瘍様の包含は、約2センチメートルの深さまでNIRFによって検出可能であることを示す。これより深い包含は、重なり合う幻影組織に切開が行われた後に検出可能である。包含が取り除かれた後、外科医はNIRFイメージを評価する。腫瘍の存在を示す残りの蛍光は、不完全な除去を示し、その後切除される。

JoVE の近赤外線イメージングの紹介を見たばかりです。ここで、蛍光色素の励起と放出の原理、生体内およびex vivo NIRFイメージングのための動物の調製方法、およびいくつかの生物医学アプリケーションを理解する必要があります。見ていただきありがとうございます!

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Results

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腹部大動脈瘤(AAA)を有するげっ歯類から撮影した生体内およびex vivo NIRF画像の代表を図1-2に示す。活性化可能な蛍光プローブを尾静脈を介して全身的に注入し、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2(MMP2)活性を可視化した。MMP2は、AAAの開始および進行に大きな役割を果たす細胞外マトリックスの分解に関与するエラストリスティック酵素である。すべての画像は、625 nm励起フィルタ、700 nm発光フィルタ、および60秒露光時間を用いて取得した。

Figure 1
図1:アンジオテンシンIIの注入後にAAAを発症したアポリポタンパク質E欠損マウスの生体内NIRF画像の代表者。高いシグナルを示す小さな斑点のほとんどは、皮膚の自己蛍光(黄色の矢印)からのものである。血管系は、高い蛍光シグナル(赤い矢印)を有する管状構造として可視化することができる。スケールバー:1センチメートル。

図2は、腹部大動脈の健康領域に対するシグナル強度の観察された増加によって見られる腹部大動脈の動脈瘤領域におけるMMP2活性の増加を示す。この結果は、AAA 内の MMP2 レベルの上昇を示す文献の結果と一致します。過剰な蛍光プローブを濾過し、腎臓に蓄積し、明るい蛍光シグナルを導いた。

Figure 2
図2: 2つの異なる動物モデルからのAAAのNIRF画像:(A)アンジオテンシンII注入アポリポプロテイン-E欠損マウスにおける副腎AAAと(B)豚膵臓エラスターゼを注入したラットにおけるインフラレナルAAA黄色の矢印は AAA を指します。スケールバー:3ミリメートル。

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Applications and Summary

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NIRFイメージングは、蛍光プローブに依存して、組織内の生体分子アセンブリを定量化し、可視化します。近赤外光から吸収された光子エネルギーは蛍光分子をより高いエネルギー状態に励起し、より長い特性波長の発光光を蛍光イメージングシステムによって捕捉します。ここで、腹部大動脈瘤におけるMMP2活性を研究するNIRFイメージングの応用は、生体内およびex vivoにおいて実証された。体内の代謝過程を非侵襲的に研究する際の金本位と考えられているSPECTやPETとは異なり、NIRFイメージングは放射線のイオン化を伴わない迅速かつ高スループットのイメージング技術です。このモダリティの制限の1つは、比較的小さな浸透深さです。この制限は、深い組織の臨床イメージングを困難にしますが、NIRFイメージングは、小動物の腫瘍および心血管疾患を研究する重要な役割を果たしています。

適切な蛍光プローブを考えると、提示されたNIRFイメージング手順を用いて多くの分子構造を可視化し、小動物モデルにおける疾患の開始と進行の両方を研究することができる。特定のex vivoおよびin vivoアプリケーションには、1)げっ歯類血管におけるMMP活性の評価、2)異なるタイプの癌における早期腫瘍検出、および3)ナノ粒子薬物動態および治療用途のためのバイオ分布の評価が含まれる。AAA内のMMP2活性の増加に加えて、他のMMP蛍光プローブは、アテローム性動脈硬化症の進行を研究し、心筋梗塞後の心臓細胞外マトリックス組成物を特徴付けるために利用されている。さらに、フルオロフォアインドシアニングリーンは、後肢虚血のマウスモデルにおける組織灌流を研究するために使用されている。早期がん検出におけるNIRFイメージングの応用について詳しく説明するために、腫瘍標的性NIRF染料を使用して腫瘍のマージンを評価し、切除手順を支援することができます。近赤外線蛍光色素を薬物送達用に開発したナノ粒子に統合することで、科学者は様々な疾患に対してより効果的なナノ粒子ベースの治療薬を開発することができます。最後に、動物全体または無傷の組織における蛍光シグナルを空間的に局在させる能力は、動物を犠牲にして組織を均質化する必要がある他の従来の酵素アッセイ(ゲルザイモグラフィー)およびタンパク質分析(ウェスタンブロット)に対して明らかな利点です。

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