Detta protokoll beskriver hur du skapar elektroder kolfiber. Elektroderna är sedan används för att upptäcka katekolamin släppa från vesikler med kolfiber amperometry.
Abstract
Kolfiber elektroder är avgörande för detektion av katekolaminer befrielse från blåsor i enstaka celler för amperometry mätningar. Här beskriver vi de tekniker som behövs för att generera låg ljudnivå (<0,5 Pa) elektroder. De tekniker har ändrats från publicerade beskrivningar av tidigare forskare (1,2). Elektroder görs genom att förbereda kolfiber och trä dem individuellt till varje kapillärrör med en dammsugare med ett filter för att aspirera fibern. Därefter är det kapillärröret med fiber som dras av en elektrod avdragare, skapa två halvor, vardera med en fin spets. Elektroderna doppas i hett, flytande epoxi blandat med härdare för att skapa en epoxy-glasförseglingen. Slutligen är de elektroder placeras i en ugn för att bota epoxi. Noggrann hantering av elektroderna är avgörande för att säkerställa att de är konsekvent och utan skador. Detta protokoll visar hur man fabricera och klippa amperometriska elektroder för inspelning från enstaka celler.
Protocol
Del 1: kolfiber Förberedelser Klipp en bunt av kolfibrer (vi använder 7μm diameter) med en längd som är ~ 1,25 x längden på kapillär pipetten. Ta bort storleken bestäms av kokande ~ 100 ml aceton i en behållare och lägga fibrerna för att den varma, kokande aceton i 30 minuter eller längre. Ta bort fibrerna från den varma aceton, och överför till en ren bägare med 50-100 ml rent aceton. Torra fibrer genom att placera bunten på en öppen 150 mm petriskål och aird…
Discussion
Detta protokoll beskriver hur du skapar och skär amperometriska elektroder. Under amperometriska inspelningar, är ett kolfiber elektrod placeras mot ytan av en sekretorisk cell. Exocytotic aktivitet observerats som amperometriska spikar, som anger elektrokemiska nuvarande orsakas av överföringen av elektroner efter oxidering av katekolaminer. Med övning gör och skärning amperometriska elektroder, kan bullernivån vara mycket bättre än många av de kommersiellt tillgängliga elektroderna.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Aron P. Fox vid University of Chicago, i vars laboratorium detta protokoll ursprungligen konstruerats, och William Roden (Saint Louis University) för vidareutveckling av protokollet.
Vi tackar Whitehall Foundation och National Science Foundation för stöd.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes
Reagent
Sigma Aldrich
P23954-100G04 716AJ
Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.