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Microbiology

Cultures d'enrichissement : Cultiver des microbes aérobies et anaérobies sur les médias sélectifs et différentiels

Overview

Source: Christopher P. Corbo1, Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1
1 Département des sciences biologiques, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

Les cellules procaryotes sont capables d'habiter presque tous les environnements de cette planète. En tant que royaume, ils possèdent une grande diversité métabolique, leur permettant d'utiliser une grande variété de molécules pour la production d'énergie (1). Par conséquent, lors de la culture de ces organismes en laboratoire, toutes les molécules nécessaires et spécifiques nécessaires à la mise en énergie doivent être fournies dans les médias de croissance. Alors que certains organismes sont métaboliquement diversifiés, d'autres sont capables de survivre dans des environnements extrêmes tels que des températures élevées ou basses, un pH alcalin et acide, des environnements réduits ou absents en oxygène, ou des environnements contenant beaucoup de sel (2,3,4). Qualifiés d'« extrémophiles », ces organismes ont souvent besoin de ces environnements intenses pour proliférer. Lorsque les scientifiques cherchent à cultiver de tels organismes, les composants des médias ainsi que toutes les conditions environnementales spécifiques doivent tous être pris en compte afin de cultiver avec succès les organismes d'intérêt.

Les scientifiques sont capables de cultiver des organismes culturables en laboratoire parce qu'ils comprennent les exigences spécifiques dont ces espèces ont besoin pour croître. Cependant, les organismes culturables représentent moins de 1 % des espèces estimées à être sur la planète (5). Les organismes que nous avons détectés par séquençage génétique mais qui ne sont pas en mesure de croître en laboratoire sont considérés comme incultes (6). À l'heure actuelle, nous n'en savons pas assez sur le métabolisme et les conditions de croissance de ces organismes pour reproduire leur environnement en laboratoire.

Des organismes exigeants se situent quelque part entre les deux premiers. Ces organismes sont culturables, mais ils nécessitent des conditions de croissance très spécifiques, telles que des composants spécifiques des médias de croissance et/ou des conditions de croissance spécifiques. Deux exemples de ces genres sont Neisseria sp. et Haemophilus sp., qui nécessitent tous deux des globules rouges partiellement décomposés (également connu sous le nom d'agar de chocolat), ainsi que des facteurs de croissance spécifiques et un environnement riche en dioxyde de carbone (7). Sans tous les composants spécifiques requis, ces organismes ne se développeront pas du tout. Souvent, même avec toutes leurs exigences, ces organismes se développent mal.

Contrairement aux cellules eucaryotes, qui ne peuvent se développer que dans un environnement aérobie ou contenant de l'oxygène, les cellules procaryotes sont capables de se développer anaérobie en utilisant plusieurs voies de fermentation pour générer suffisamment d'énergie (8). D'autres procaryotes préfèrent un environnement microaérophile, ou réduit d'oxygène, ou même un environnement capnophilique, ou à haute teneur en dioxyde de carbone (9). Ces organismes sont plus difficiles à enrichir, car l'atmosphère doit être modifiée. Les scientifiques qui travaillent fréquemment avec des organismes sensibles à un environnement oxygéné travailleraient normalement dans une chambre anaérobie et un incubateur, où un gaz lourd et inerte comme l'argon est pompé pour déplacer l'oxygène (10). D'autres utilisent des systèmes de paquets de gaz scellés disponibles de façon conventionnelle qui utilisent de l'eau pour produire de l'hydrogène et du dioxyde de carbone, ainsi qu'un catalyseur comme le palladium pour éliminer tout l'oxygène atmosphérique. Ces kits disponibles dans le commerce peuvent créer l'une des conditions atmosphériques mentionnées ci-dessus (10).

Qu'il s'agisse de cultiver un agent pathogène pour déterminer une infection potentielle ou de chercher à identifier une espèce spécifique de bactéries présentes dans un environnement naturel, un problème existe. Aucune espèce bactérienne n'habite un seul habitat. Les bactéries vivent comme des communautés multicellulaires partout, de la peau des humains aux océans de notre planète (11). Lorsqu'ils tentent d'isoler une espèce de bactéries, les scientifiques doivent s'efforcer d'exclure les nombreux autres organismes qui habitent également la zone isolée. Pour cette raison, les supports de croissance enrichis pour les bactéries exercent souvent deux fonctions. La première est de rendre les médias sélectifs. Un agent sélectif empêchera certaines espèces de croître, sans qu'elles n'inhibent et, souvent, ne favorisent même pas la croissance d'autres espèces (12). La deuxième fonction des ingrédients des médias peut être de travailler comme agents différentiels. Ces agents permettent l'identification d'une caractéristique biochimique particulière d'un organisme isolé. En jumelant plusieurs médias sélectifs et différentiels différents ainsi que des conditions de croissance appropriées, les scientifiques et les diagnostiqueurs sont en mesure d'identifier la présence d'espèces bactériennes spécifiques à partir d'un isolat particulier.

Un exemple d'un média sélectif et différentiel aidant à l'identification est dans le cas de l'organisme cliniquement significatif Staphylococcus aureus. Cet organisme est généralement cultivé sur l'agar de sel de mannitol. Ce milieu sélectionne non seulement pour les organismes qui peuvent vivre dans un environnement de haute teneur en sel, qui comprennent certains grammes positifs comme Le Staphylococcus, mais il inhibe également tous les organismes sensibles au sel. Le sucre de mannitol est la composante différentielle de ce milieu. De toutes les espèces de Staphylococcus cliniquement significatives, seul S. aureus est capable de fermenter le mannitol. Cette réaction de fermentation produit de l'acide comme sous-produit, ce qui fait jaunir l'indicateur rouge rétorque dans les médias. D'autres espèces de Staphylococcus (comme Staphylococcus epidermidis) bien que capables de croître, laisseront les médias de couleur rouge.

Cet exercice de laboratoire démontre la technique aseptique appropriée, aussi bien que l'inoculation appropriée des médias de croissance du bouillon. Il introduit également la croissance d'organismes contaminants communs sur les supports d'enrichissement, l'utilisation d'un système de culture anaérobie paquet de gaz pour les bactéries anaérobies, et l'utilisation de différents médias sélectifs et différentiels pour l'identification présumée de gram bactéries positives et gramnégatives.

Procedure

1. Préparation

  1. Avant de commencer, lavez-vous soigneusement les mains et mettez des gants de taille appropriée.
  2. Stériliser la surface de travail avec 5 % d'hypochlorite de sodium (blanchiment) et bien sécher.
  3. Placez une boucle isolante dans un flacon Erlenmeyer vide de 120 ml afin qu'il ne touche pas le dessus du banc pendant le travail.

2. Médias et cultures de croissance

  1. Rassemblez quatre assiettes de Mannitol Salt Agar (MSA), eosin Methylène agar bleu (EMB), et huit agar de soja tryptique (TSA) du réfrigérateur (ceux-ci peuvent être achetés commercialement).
  2. Placer les assiettes sur l'aire de travail nettoyée.
  3. Rassemblez les cultures suivantes de bouillon : Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, et Proteus vulgaris. Soyez prudent : comme il s'agit d'organismes aérobies, les bouchons des tubes doivent être légèrement lâches.
  4. Placez toutes les cultures dans un support de tube à essai sur la surface de travail nettoyée.

3. Transfert de cultures et d'incubation

  1. Tenez-vous debout ou asseyez-vous sur le banc avec tous les matériaux à portée de main.
  2. Pour utiliser la technique aseptique pour transférer les bactéries dans la plaque, d'abord la flamme de la boucle jusqu'à ce qu'elle soit orange rougeoyante - puis laissez-la refroidir dans l'air.
  3. Pendant que la boucle se refroidit, prenez la culture de bouillon de E. coli,puis ouvrez le bouchon à l'aide de votre doigt rose.
  4. Flamme l'ouverture du tube rapidement. Cela empêche la contamination.
  5. Trempez la boucle dans le tube et striez l'organisme sur le premier quadrant d'une plaque d'OGE.
  6. Après la première série est effectuée, la flamme de la boucle, puis effectuer une deuxième série traversant la première série qu'une ou deux fois. Cela permettra l'isolement d'une seule colonie et déterminera s'il y a une contamination.
  7. Répétez cette opération jusqu'à ce que les quatre quadrants de la plaque aient été striés.
  8. Maintenant, transférez chacun des quatre organismes de la même manière de placage de série de sorte que le produit final soit une plaque MSA, une plaque d'EMB, et deux plaques séparées de TSA par organisme.
  9. Une fois que tous les organismes ont été transférés, enflammez la boucle une dernière fois et rangez-la.
  10. Placer 1 plaque TSA avec chaque organisme dans le paquet de gaz, puis secouer un sachet de gaz avant de le placer dans la chambre à côté des plaques. Scellez fermement.
  11. Incuber toutes les assiettes à 37oC pendant la nuit.
  12. Stériliser la surface de travail une dernière fois avec 5% d'eau de Javel.

4. Résultats de lecture et d'enregistrement

  1. Retirez les plaques de l'incubateur et placez-les sur un banc de laboratoire propre
  2. Prenez note de la croissance des organismes sur chaque plaque de votre ordinateur de laboratoire. En particulier, prenez des notes détaillées sur :
    1. Nombres et taille des colonies (si présent) sur chaque assiette, pour chaque souche plaquée
    2. Apparition de l'agar entourant les colonies poussant sur les plaques MSA
    3. Apparition de toutes les colonies poussant sur les plaques de l'OGE
    4. Différences de croissance entre les plaques TSA cultivées à l'extérieur par rapport à l'intérieur de l'emballage de gaz

Les bactéries sont capables d'habiter presque tous les environnements de la Terre, de la toundra du désert aux forêts tropicales humides. Cette capacité à coloniser des niches très différentes est due à leur adaptabilité et à leur grande diversité métabolique, ce qui leur permet d'utiliser une grande variété de molécules pour la production d'énergie. C'est ce vaste éventail de diversité qui conduit au phénomène que moins de 1% des espèces bactériennes sur la planète sont considérées comme culturables et celles-ci ne sont possibles que par une compréhension de leurs besoins métaboliques et environnementaux spécifiques.

L'exécution de manipulations des médias et de l'environnement en laboratoire permet non seulement aux chercheurs d'expérimenter pour trouver les conditions optimales pour la culture d'une espèce d'intérêt, mais elle permet également l'enrichissement, le processus de changement des conditions à choisir pour espèces spécifiques d'une culture mixte. Certaines espèces microbiennes sont généralistes et capables de tolérer une grande variété d'états ou d'environnements. Ces organismes peuvent se développer facilement dans des conditions de laboratoire, mais ils peuvent également être empêchés de croître s'ils reçoivent un habitat extrême - ce qui peut aider si l'objectif est d'enrichir pour les organismes d'une culture mixte qui sont tolérants à cette condition.

Les organismes exigeants peuvent être culturables, mais seulement lorsque des conditions spécifiques sont remplies. Les espèces de Neisseria ou haemophilus, par exemple, nécessitent des supports contenant des globules rouges partiellement décomposés et une forte concentration de dioxyde de carbone, ce qui peut également décourager la croissance d'autres espèces. Les extrémophiles sont nommés en fonction de leur préférence pour les conditions extrêmes, telles que des températures très basses ou élevées, des conditions réduites ou d'absence d'oxygène, ou en présence de haute teneur en sel. Ces conditions sont probablement intolérables à la plupart des autres microbes.

Pour enrichir davantage pour un organisme d'intérêt, certains types de médias contiennent des indicateurs qui donnent un aperçu du métabolisme de l'organisme. Mannitol Salt Agar inhibe la croissance d'organismes sensibles au sel élevé. Gram bactéries négatives ne peuvent généralement pas survivre, mais le genre Gram positif Staphylococcus sont en mesure de prospérer. En outre, l'agar MSA indique toutes les colonies capables de fermenter le mannitol parce que les sous-produits acides de la fermentation transformeront l'indicateur rouge méthyle dans les médias à un jaune vif. Cela peut permettre une sélection plus spécifique d'une espèce.

Un autre moyen d'enrichissement courant, Eosin Methylène Blue, contient de l'éosine et des colorants bleus méthylène, qui sont toxiques pour les organismes positifs au gramme. Il contient également du lactose et des bactéries sur ces plaques qui peuvent fermenter ce qui produira des acides qui abaissent le pH encourageant l'absorption des colorants. Ces colonies prennent de grandes quantités de pigments et semblent sombres et métalliques. Dans ce laboratoire, vous cultiverez quatre organismes d'essai différents à travers trois conditions différentes de médias, puis dans des conditions aérobies par rapport à des conditions anaérobies avant d'observer leur développement.

Avant de commencer l'expérience, lavez-vous soigneusement les mains et séchez-les, avant de mettre des gants de laboratoire de taille appropriée. Ensuite, stérilisez la surface de travail avec 5% d'eau de Javel, en l'essuyant complètement. Ensuite, prenez une boucle d'inoculation stérile et placez-la manipuler vers le bas dans un flacon vide de 125 millilitres de sorte qu'il ne touche pas la surface du banc. Puis, à partir du réfrigérateur, rassemblez quatre assiettes de Mannitol Salt Agar, ou MSA, quatre assiettes d'agar eosin Methylène Blue, EMB, et huit tryptic Soy Agar, ou TSA, assiettes. Le milieu TSA est un milieu de croissance non sélectif qui sera utilisé pour les deux conditions environnementales différentes. Enfin, rassemblez vos cultures d'intérêt dans un support à tubes. Ici, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epiderme, et Proteus vulgaris sera cultivé.

Pour commencer, allumez un brûleur Bunsen, qui sera utilisé pour stériliser les outils. Ensuite, placez une plaque MSA, une plaque EMB et deux plaques TSA à portée de main. Ensuite, sélectionnez l'une des cultures bactériennes. Vous inoculez ces quatre plaques avec la première culture. Avec votre main libre, prenez la boucle inoculante, puis stérilisez-la dans la flamme du brûleur jusqu'à ce qu'il brille orange pendant quelques secondes. Laisser la boucle refroidir dans l'air. Ensuite, ouvrez le tube de culture de bouillon et flammez rapidement l'ouverture. Trempez la boucle dans la culture, puis stries de l'organisme sur le premier quadrant de la première plaque. Puis la flamme stérilisez à nouveau la boucle et strie le deuxième quadrant. Répétez cette action de stérilisation des flammes, puis stries pour compléter les troisième et quatrième quadrants. Le triage de cette manière devrait donner des colonies isolées et permettre également la confirmation que la culture n'est pas contaminée.

Maintenant, remplacez le couvercle et étiquetez le bas de la plaque avec le nom de la bactérie, le type de média, la date et vos initiales. Ensuite, répétez le placage de strie en utilisant la même culture bactérienne pour chacune des trois plaques restantes en prenant soin de les étiqueter à chaque fois. Maintenant que la première culture a été strié, répétez ces étapes pour les autres bactéries pour obtenir une plaque MSA inoculée, une plaque embuée, et deux plaques TSA pour chaque espèce. Une fois que tous les organismes ont été transférés, flamme zeter la boucle une dernière fois.

Pour déterminer quels organismes peuvent se développer dans un environnement d'oxygène réduit, ouvrez un système de chambre à gaz scellé et placez un ensemble de quatre plaques de bactéries TSA à l'intérieur. Ensuite, placez un sachet anaérobie dans la chambre et scellez-le hermétiquement. Enfin, placez toutes les plaques, y compris celles à l'intérieur du système de chambre à gaz scellée, dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant la nuit. À l'avenir, vérifiez les plaques toutes les 24 à 48 heures pour donner aux colonies le temps de croître et de métaboliser les réactifs de l'indicateur.

Pour évaluer dans quelle mesure les différentes espèces bactériennes ont réagi à chaque condition de croissance, examinez d'abord les plaques pour la croissance et enregistrez quelles espèces ont pu produire des colonies sur chaque type de média et dans l'état anaérobie par rapport à l'aérobie. Notez la couleur des organismes qui poussent ainsi que la taille et la forme des colonies.

Le milieu d'agar de sel de mannitol est sélectif pour des organismes positifs de gramme qui peuvent survivre dans 6. 5% de chlorure de sodium. Dans cette expérience, cela signifiait que le gramme négatif E. coli et P. vulgaris n'a pas grandi en raison des fortes concentrations de sel. S. epiderme et S. aureus ont toutefois pu se développer, confirmant qu'ils sont gram positifs. En outre, il ya une nette différence entre les deux espèces parce que le S. aureus est capable de fermenter mannitol tournant l'indicateur rouge méthyle dans les médias à un jaune vif en raison des sous-produits acides de la fermentation. Cela n'a pas été vu dans le cas de S. epiderme.

Le milieu de l'OGE, d'autre part, est sélectif pour les organismes gram négatifs parce que l'éosine et les colorants bleus de méthylène sont toxiques pour les cellules gram positives. La membrane externe des bactéries gram négatives empêche ces colorants toxiques d'entrer dans les cellules, ce qui signifie qu'ils sont capables de croître. De plus, ce milieu indique si les espèces bactériennes présentes sont capables de fermenter le lactose. Ici, les colonies d'E. coli deviennent de couleur violet foncé, parfois avec un éclat métallique vert indiquant la fermentation. P. vulgaris pousse sur ce milieu mais ne fermente pas le lactose et apparaît ainsi un rose clair au violet d'être en présence de la teinture. Dans l'état anaérobie, les espèces bactériennes sur les médias TSA devrait encore croître, mais peut le faire très mal par rapport à ceux qui ont suffisamment d'oxygène. C'est parce qu'aucune des espèces d'essai ne sont obligatoires anaerobes.

Des expériences comme celle-ci pour enrichir l'environnement de croissance peuvent aider à favoriser et à isoler une espèce spécifique d'un échantillon mixte. Ils peuvent également aider à déterminer les conditions de croissance optimales pour différentes espèces bactériennes en laboratoire, ce qui facilite la poursuite des recherches.

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Results

Maner Mannitol Salt Agar (MSA): Ce milieu est sélectif pour les organismes gram positifs qui sont capables de survivre dans 6,5% de chlorure de sodium. Les organismes gram-négatifs Escherichia coli et Proteus vulgaris ne devraient pas pouvoir se développer sur ce milieu en raison de la forte concentration de sel. S. epidermidis et S. aureus devraient pouvoir se développer. Le média est différentiel entre les deux parce que le S. aureus est capable de fermenter le mannitol - tournant l'indicateur rouge méthyle jaune vif en raison de la production d'acide comme sous-produit de fermentation. S. epidermidis devrait maintenir la couleur rose sur la plaque.
REMARQUE: Si les colonies sont petites, la croissance sur ce milieu peut nécessiter une incubation supplémentaire pour un total allant jusqu'à 48 heures à une température optimale - ici, 37 oC.

Eosin Methylène Blue agar (EMB): Ce milieu est sélectif pour les organismes gram négatifs, de sorte que les plaques Escherichia coli et Proteus vulgaris devraient montrer une croissance. Les colorants bleu ésoosine et méthylène sont toxiques pour les cellules gram positives de sorte que ni les espèces de Streptococcus ne devraient croître. La membrane externe des cellules gramnégatives empêche les colorants d'entrer dans les cellules. Ce média est différentiel car il permet de tester la capacité de l'organisme à fermenter le lactose. E. coli prend une couleur violette vive (souvent avec un éclat métallique vert si cultivé assez longtemps) en raison de la fermentation du lactose dans les médias. Le P. vulgaris, bien que capable de croître, ne fermente pas le lactose (toutefois il est capable de fermenter d'autres sucres).

Tryptic Soy Agar (TSA): Ce milieu n'est pas sélectif, de sorte que toutes les espèces étudiées devraient croître. Cependant, en comparant les conditions aérobies par rapport aux conditions anaérobies, les plaques de l'emballage de gaz devraient afficher moins de croissance (et de plus petites colonies). C'est parce qu'aucune des bactéries cultivées dans la démonstration sont des aerobes obligatoires, mais leur état de croissance optimal inclut l'oxygène.

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Applications and Summary

Différentes espèces bactériennes sont capables de se développer dans différents environnements et sont en mesure d'utiliser différentes sources de carbone comme un moyen de générer de l'énergie. Lorsque vous travaillez avec ces cultures en laboratoire, il est important de connaître les composantes des médias de croissance en cours de travail et de faire correspondre les médias de croissance à l'espèce bactérienne. Les scientifiques et les diagnostiqueurs peuvent également exploiter les différentes réactions biochimiques comme un moyen d'isoler différentes espèces des autres et comme un moyen de distinguer et d'identifier les bactéries dans un environnement mixte.

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References

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