Overview
מקור: כריסטופר פ. קורבו1,ג'ונתןפ. בלייז 1 , אליזבת סוטר1
1 המחלקה למדעי הביולוגיה, מכללת וגנר, דרך הקמפוס 1, סטטן איילנד ניו יורק, 10301
תאים פרוקריוטים מסוגלים לאכלס כמעט כל סביבה על פני כדור הארץ. כממלכה, יש להם מגוון מטבולי גדול, המאפשר להם להשתמש במגוון רחב של מולקולות לייצור אנרגיה (1). לכן, בעת טיפוח אורגניזמים אלה במעבדה, כל המולקולות הדרושות והספציפיות הנדרשות כדי לייצר אנרגיה חייבות להיות מסופקות במדיה הצמיחה. בעוד אורגניזמים מסוימים הם מגוונים מטבולית, אחרים מסוגלים לשרוד בסביבות קיצוניות כגון טמפרטורות גבוהות או נמוכות, pH אלקליין וחומצי, ירידה או חמצן ללא סביבות, או סביבות המכילות מלח גבוה (2,3,4). המכונה "קיצוניים", אורגניזמים אלה דורשים לעתים קרובות סביבות אינטנסיביות אלה להתרבות. כאשר מדענים מחפשים לגדל אורגניזמים כאלה, מרכיבי התקשורת, כמו גם כל תנאים סביבתיים ספציפיים כל צריך להילקח בחשבון על מנת לטפח בהצלחה את האורגניזמים של עניין.
מדענים מסוגלים לגדל אורגניזמים פולחניים במעבדה מכיוון שהם מבינים את הדרישות הספציפיות שמינים אלה צריכים לגדול. עם זאת, אורגניזמים כת מהווים פחות מ -1% מהמינים המוערך על פני כדור הארץ (5). אורגניזמים שזיהינו על ידי ריצוף גנים אך אינם מסוגלים לגדול במעבדה נחשבים בלתי ניתנים לחישוב (6). בשלב זה, אנחנו לא יודעים מספיק על חילוף החומרים ותנאי הצמיחה של אורגניזמים אלה כדי לשכפל את הסביבה שלהם במעבדה.
אורגניזמים בררניים שוכבים איפשהו בין השניים הקודמים. אורגניזמים אלה ניתנים לפולחן, אך הם דורשים תנאי צמיחה ספציפיים מאוד, כגון רכיבי מדיה לצמיחה ספציפיים ו / או תנאי גדילה ספציפיים. שתי דוגמאות של סוגים כאלה הם Neisseria sp. ו Haemophilus sp., שניהם דורשים חלקית מפורק תאי דם אדומים (הידוע גם בשם אגר שוקולד), כמו גם גורמי גדילה ספציפיים וסביבה עשירה פחמן דו חמצני (7). ללא כל המרכיבים הספציפיים הנדרשים, אורגניזמים אלה לא יגדלו כלל. לעתים קרובות, אפילו עם כל הדרישות שלהם, אורגניזמים אלה לגדול בצורה גרועה.
שלא כמו תאים אאוקריוטים, אשר מסוגלים רק לגדול בסביבה אירובית, או חמצן המכיל, תאים פרוקריוטיים מסוגלים לגדול אנאירובי באמצעות מספר מסלולי תסיסה כדי לייצר אנרגיה בשפע (8). פרוקריוטים אחרים מעדיפים סביבת חמצן מיקרו-אירופילית, או מופחתת, או אפילו סביבת קנופילית או פחמן דו חמצני גבוהה (9). אורגניזמים אלה מאתגרים יותר להעשיר עבור, שכן האטמוספירה חייבת להשתנות. מדענים שעובדים לעתים קרובות עם אורגניזמים רגישים לסביבה מחומצנת היו עובדים בדרך כלל בתא אנאירובי ובאינקובטור, שם שואב גז כבד, אינרטי כמו ארגון, כדי לעקור את החמצן (10). אחרים עושים שימוש במערכות מנות גז אטום זמינות באופן קונבנציונלי המשתמשות במים כדי לייצר מימן ופחמן דו חמצני, יחד עם זרז כמו פלדיום כדי להסיר את כל החמצן האטמוספרי. ערכות זמינות מסחרית אלה יכולות ליצור כל אחד מהתנאים האטמוספריים שהוזכרו לעיל (10).
בין אם מטפחים פתוגן כדי לקבוע זיהום פוטנציאלי או מחפשים לזהות מין מסוים של חיידקים הנמצאים בסביבה טבעית, קיימת בעיה אחת. אף מין חיידקי לא שוכן בבית גידול אחד. חיידקים חיים כקהילות רב-תאיות בכל מקום, מעורם של בני האדם ועד לאוקיינוסים של כוכב הלכת שלנו (11). כאשר מנסים לבודד מין אחד של חיידקים, מדענים חייבים לעבוד כדי להוציא את האורגניזמים הרבים האחרים המאכלסים גם את האזור המבודד. מסיבה זו, מדיה צמיחה מועשרת עבור חיידקים לעתים קרובות לבצע שתי פונקציות. הראשון הוא להפוך את המדיה לסלקטיבית. סוכן סלקטיבי ימנע מינים מסוימים לגדול, תוך לא מעכב ולעתים קרובות אפילו לקדם אחרים לגדול (12). הפונקציה השנייה של מרכיבי מדיה עשויה להיות לעבוד כסוכנים דיפרנציאליים. סוכנים כאלה מאפשרים זיהוי של תכונה ביוכימית מסוימת של אורגניזם מבודד. על ידי שיוך מספר מדיות סלקטיביות ודיפרנציאליות שונות יחד עם תנאי גדילה מתאימים, מדענים ומאבחנים מסוגלים לזהות את נוכחותם של מינים חיידקיים ספציפיים מניתג מסוים.
דוגמה אחת למדיה סלקטיבית ודיפרנציאלית המסייעת בזיהוי היא במקרה של האורגניזם המשמעותי מבחינה קלינית Staphylococcus aureus. אורגניזם זה הוא בדרך כלל תרבותי על אגר מלח מניטול. מדיה זו לא רק בוחרת רק אורגניזמים אשר יכולים לחיות בסביבה מלח גבוהה, הכוללים כמה חיובי גרם כמו Staphylococcus, אבל זה גם מעכב כל אורגניזמים רגישים למלח. סוכר המניטול הוא המרכיב הדיפרנציאלי של המדיום הזה. מכל מיני סטפילוקוקוס בעלי משמעות קלינית, רק ס. אוריוס מסוגל לתסוס מניטול. תגובת תסיסה זו מייצרת חומצה כמוצר לוואי אשר גורם מחוון אדום מתיל אדום במדיה להפוך צהוב. מינים אחרים של סטפילוקוקוס (כגון סטפילוקוקוס אפידרמידיס) למרות שהם מסוגלים לגדול, ישאירו את התקשורת אדומה בצבע.
תרגיל מעבדה זה מדגים טכניקה אספטית נכונה, כמו גם חיסון נכון של מדיה צמיחה מן המרק. הוא גם מציג את הצמיחה של אורגניזמים מזהמים נפוצים על מדיית העשרה, את השימוש במערכת תרבית אנאירובית של חבילת גז לחיידקים אנאירוביים, ואת השימוש באמצעי אחסון סלקטיביים ודיפרנציאליים שונים לזיהוי חזק של חיידקים חיוביים וגרם שליליים.
Procedure
1. הכנה
- לפני שמתחילים, לשטוף ידיים ביסודיות ולשים כפפות בגודל מתאים.
- לחטא משטח עבודה עם 5% נתרן hypochlorite (אקונומיקה) ולייבש ביסודיות.
- מניח לולאה מחוקנת בבקבוק ארלנמאייר ריק של 120 מ"ל, כך שהוא לא נוגע בחלק העליון של הספסל תוך כדי עבודה.
2. צמיחה מדיה ותרבויות
- אסוף ארבע צלחות של מניטול מלח אגר (MSA), אגר כחול אאוזין מתילן (EMB), ושמונה אגר סויה טריפטי (TSA) מהמקרר (אלה ניתן לרכוש מסחרית).
- מניחים צלחות על פינת העבודה המנוקה.
- אסוף את תרביות המרק הבאות: אשריצ'יה קולי, סטפילוקוקוס אאורוס, סטפילוקוקוס אפידרמידיס ופרוטאוס וולגאריס. היזהר: כמו אלה הם אורגניזמים אירוביים, כובעי הצינורות צריך להיות מעט רופף.
- הנח את כל התרבויות בארון מבחנה על משטח העבודה המנוקה.
3. העברת תרבויות ודגרה
- עמדו או שבו ליד הספסל כשכל החומרים בהישג יד.
- כדי להשתמש בטכניקה אספטית כדי להעביר את החיידקים לצלחת, תחילה להבה את הלולאה עד שהוא זוהר כתום - ולאחר מכן לאפשר לו להתקרר באוויר.
- בזמן שהלולאה מתקררת, קחו את תרבות המרק של אי קולי, ואז פתחו את הכובע בעזרת האצבע הזרת.
- להבה את הפתיחה של הצינור במהירות. זה מונע זיהום.
- טובלים את הלולאה לתוך הצינור ומעבירים את האורגניזם לרביע הראשון של צלחת EMB.
- לאחר ביצוע הרצף הראשון, להב את הלולאה, ולאחר מכן לבצע פס שני חוצה את הרצף הראשון רק פעם או פעמיים. זה יאפשר בידוד מושבה אחת ולקבוע אם יש זיהום כלשהו.
- חזור על זה עד שכל ארבעת הרבעים של הצלחת כבר פסים.
- עכשיו, להעביר כל אחד משאר ארבעת האורגניזמים באותו אופן ציפוי פס כך שהמוצר הסופי הוא צלחת MSA אחת, צלחת EMB אחת, ושתי צלחות TSA נפרדות לכל אורגניזם.
- ברגע שכל האורגניזמים הועברו, להב את הלולאה בפעם האחרונה והניח אותה בצד.
- מניחים צלחת TSA אחת עם כל אורגניזם לתוך חבילת הגז, ולאחר מכן לנער שקית גז לפני הנחת אותו לתוך התא לצד הצלחות. אוטם בחוזקה.
- יש לדגור על כל הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לחטא את משטח העבודה בפעם האחרונה עם 5% אקונומיקה.
4. תוצאות קריאה והקלטה
- מוציאים את הצלחות מהחממה ומניחים אותן על ספסל מעבדה נקי
- שים לב לצמיחה של האורגניזמים על כל צלחת במחברת המעבדה שלך. בפרט, רם הערות מפורטות על:
- מספרים וגודל מושבות (אם קיימים) על כל צלחת, עבור כל זן מצופה
- מראה הגר סביב כל המושבות הגדלות על לוחות ה- MSA
- המראה של כל המושבות הגדלות על לוחות EMB
- הבדלים בצמיחה בין לוחות TSA גדל בחוץ לעומת בתוך חבילת הגז
חיידקים מסוגלים לאכלס כמעט כל סביבה על פני כדור הארץ, מטונדרה מדברית ליערות גשם טרופיים. יכולת זו ליישב נישות שונות בהרבה נובעת מיכולת ההסתגלות שלהן ומהמגוון המטבולי העצום שלהן, המאפשר להן להשתמש במגוון רחב של מולקולות לייצור אנרגיה. זהו מערך עצום זה של גיוון אשר מוביל לתופעה כי פחות מ -1% של מינים חיידקיים על פני כדור הארץ נחשבים culturable ואלה אפשריים רק בשל הבנה של הצרכים המטבוליים הסביבתיים הספציפיים שלהם.
ביצוע מניפולציות של מדיה וסביבה במעבדה לא רק מאפשר לחוקרים להתנסות כדי למצוא את התנאים האופטימליים עבור פולחן מין של עניין, אבל זה גם מאפשר העשרה, תהליך של שינוי תנאים לבחור עבור מינים ספציפיים מתרבות מעורבת. מינים מיקרוביים מסוימים הם גנרלים ומסוגלים לסבול מגוון רחב של מצבים או סביבות. אורגניזמים כאלה עשויים לגדול בקלות בתנאי מעבדה, אך הם עשויים גם להיות מנועים מלגדול אם ניתנה להם בית גידול קיצוני - אשר יכול לעזור אם המטרה היא להעשיר עבור אורגניזמים מתרבות מעורבת אשר סובלניים למצב זה.
אורגניזמים בררניים יכולים להיות ניתנים לפולחן, אך רק כאשר מתקיימים תנאים ספציפיים. מיני ניסריה או המופילוס, למשל, דורשים מדיה המכילה תאי דם אדומים שבורים חלקית וריכוז גבוה של פחמן דו חמצני, מה שעלול גם להרתיע את צמיחתם של מינים אחרים. אקסטרמופילים נקראים על העדפתם לתנאים קיצוניים, כגון טמפרטורות נמוכות מאוד או גבוהות מאוד, תנאים מופחתים או ללא חמצן, או בנוכחות מלח גבוה. תנאים אלה הם ככל הנראה בלתי נסבלים לרוב החיידקים האחרים.
כדי להעשיר עוד יותר עבור אורגניזם של עניין, כמה סוגי מדיה מכילים אינדיקטורים אשר נותנים תובנה על חילוף החומרים של האורגניזם. מניטול מלח אגר מעכב את הצמיחה של אורגניזמים רגישים למלח גבוה. חיידקים שליליים גרם בדרך כלל לא יכול לשרוד, אבל רצח סטפילוקוקוס חיובי גרם מסוגלים לשגשג. בנוסף, אגר MSA מציין כל מושבות מסוגל לתסוס מניטול כי תוצרי לוואי חומצה של תסיסה יהפכו את מחוון מתיל אדום במדיה לצהוב בהיר. זה יכול לאפשר בחירה ספציפית יותר של מין.
מדיום העשרה נפוץ נוסף, אאוזין מתילן כחול, מכיל אאוזין וצבעים כחולים מתילן, אשר רעילים אורגניזמים חיוביים גרם. הוא מכיל גם לקטוז וחיידקים על לוחות אלה אשר יכול תסיסה זה יפיק חומצות להורדת pH עידוד ספיגת צבע. מושבות אלה תופסות כמויות גדולות של פיגמנט ונראות כהות ומתכתיות. במעבדה זו, תגדל ארבעה אורגניזמים בדיקה שונים על פני שלושה תנאי מדיה שונים ולאחר מכן בתנאים אירוביים לעומת אנאירוביים לפני התבוננות בהתפתחותם.
לפני תחילת הניסוי, לשטוף ביסודיות את הידיים ולייבש אותם, לפני לשים על כפפות מעבדה בגודל המתאים. לאחר מכן, לחטא את משטח העבודה עם 5% אקונומיקה, מנגב אותו ביסודיות. לאחר מכן, קח לולאת חנק סטרילית והנח אותו לידית לתוך בקבוקון ריק 125 מיליליטר, כך שהוא לא נוגע משטח הספסל. לאחר מכן, מהמקרר, לאסוף ארבע צלחות של מניטול מלח אגר, או MSA, ארבע צלחות של אאוזין מתילן כחול אגר, EMB, ושמונה אגר סויה טריפטי, או TSA, צלחות. TSA medium הוא אמצעי צמיחה לא סלקטיבי אשר ישמש עבור שני התנאים הסביבתיים השונים. לבסוף, לאסוף את תרבויות העניין שלך במדף צינור. כאן, Escherichia coli, סטפילוקוקוס אאורוס, סטפילוקוקוס אפידרמיס, ופרוטאוס וולגאריס יגדלו.
כדי להתחיל, להדליק מבער Bunsen, אשר ישמש כדי לעקר את הכלים. לאחר מכן, מניחים צלחת MSA אחת, צלחת EMB אחת, ושתי צלחות TSA בהישג יד. לאחר מכן, בחר אחת מתרביות החיידקים. אתה תחסן את כל ארבעת הצלחות האלה עם התרבות הראשונה. עם היד החופשית שלך, להרים את לולאת החנק ולאחר מכן לחטא אותו בלהבת המבער עד שהוא זוהר כתום במשך כמה שניות. אפשר ללולאה להתקרר באוויר. לאחר מכן, פתחו את צינור תרבות המרק והבריזו במהירות את הפתח. טובלים את הלולאה בתרבות ואז מפסים את האורגניזם על הרביע הראשון של הצלחת הראשונה. ואז הלהבה מעקרת את הלולאה שוב ומפסה את הרביע השני. חזור על פעולה זו של עיקור להבות ולאחר מכן פסים כדי להשלים את הרביעי השלישי והרביעי. פסים בדרך זו צריכים לתת מושבות מבודדות וגם לאפשר אישור כי התרבות אינה מזוהמת.
עכשיו, החלף את המכסה וסמן את תחתית הצלחת בשם החיידקים, סוג המדיה, התאריך וראשי התיבות שלך. לאחר מכן, חזור על ציפוי הרצף באמצעות אותה תרבית חיידקית עבור כל אחת משלוש הצלחות הנותרות דואג לתייג אותם בכל פעם. כעת, לאחר שהתרבות הראשונה מפוספסת, חזור על השלבים הבאים עבור החיידקים האחרים כדי להשיג צלחת MSA מחוסנת אחת, צלחת EMB אחת, ושתי צלחות TSA עבור כל מין. ברגע שכל האורגניזמים הועברו, להב את הלולאה בפעם האחרונה.
כדי לקבוע אילו אורגניזמים יכולים לגדול בסביבת חמצן מופחתת, פתחו מערכת תאי גזים אטומה והכניסו פנימה קבוצה אחת של ארבע לוחות חיידקי TSA. לאחר מכן, מניחים שקית מצב אנאירובי לתוך החדר ולאטום אותו בחוזקה. לבסוף, מניחים את כל הלוחות, כולל אלה בתוך מערכת תאי הגזים האטומים, לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס בן לילה. בהמשך, בדקו את הלוחיות כל 24 עד 48 שעות כדי לתת למושבות זמן לגדול ולטבול כל מגיבי אינדיקטור.
כדי להעריך עד כמה הגיבו מינים חיידקיים שונים לכל מצב גדילה, תחילה לבחון את הלוחות לצמיחה ולתעד אילו מינים היו מסוגלים לייצר מושבות בכל סוג מדיה ובמצב אנאירובי לעומת אירובי. שים לב לצבע האורגניזמים הגדלים, כמו גם את הגדלים והצורה של המושבות.
מדיום אגר מלח מניטול הוא סלקטיבי עבור אורגניזמים חיוביים גרם אשר מסוגלים לשרוד ב 6. 5% נתרן כלורי. בניסוי זה, משמעות הדבר היא כי גרם שלילי E. coli ו P. וולגאריס לא גדל בשל ריכוזי המלח הגבוהים. ס. אפידרמיס ו S. aureus היו מסוגלים לגדול, עם זאת, מאשר כי הם חיוביים גרם. בנוסף, יש הבדל ברור בין שני המינים כי S. aureus הוא מסוגל לתסוס מניטול הפיכת מחוון אדום מתיל במדיה לצהוב בהיר בשל תוצרי לוואי חומצה של תסיסה. זה לא נראה במקרה של ס אפידרמיס.
המדיום EMB לעומת זאת הוא סלקטיבי עבור אורגניזמים שליליים גרם כי אאוזין ומתילן צבעים כחולים רעילים לתאים חיוביים גרם. הממברנה החיצונית של חיידקים שליליים גרם מונע צבעים רעילים אלה מלהיכנס לתאים, כלומר הם מסוגלים לגדול. יתר על כן, מדיום זה מציין אם מינים חיידקיים נוכחים הוא מסוגל תסיסה לקטוז. כאן, מושבות אי קולי הופכות צבע סגול כהה, לפעמים עם ביהק מתכתי ירוק המציין תסיסה. P. vulgaris גדל על מדיום זה אבל לא תסיסה לקטוז ולכן נראה ורדרד בהיר לסגול מלהיות בנוכחות הצבע. במצב אנאירובי, מינים חיידקיים על מדיה TSA עדיין צריך לגדול אבל יכול לעשות זאת בצורה גרועה מאוד בהשוואה לאלה עם חמצן בשפע. הסיבה לכך היא שאף אחד ממיני הניסוי אינו מחייב אנרובים.
ניסויים כאלה כדי להעשיר את סביבת הצמיחה יכולים לעזור להעדיף ולבודד מינים ספציפיים מדגם מעורב. הם יכולים גם לעזור לקבוע את תנאי הצמיחה האופטימליים עבור מינים חיידקיים שונים בסביבת מעבדה, ובכך לסייע במחקר נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
מניטול מלח אגר (MSA): מדיום זה הוא סלקטיבי עבור אורגניזמים חיוביים גרם המסוגלים לשרוד 6.5% נתרן כלורי. האורגניזמים גרם שלילי Escherichia coli ו Proteus וולגאריס לא צריך להיות מסוגל לגדול על המדיום הזה בגלל ריכוז המלח הגבוה. ס. אפידרמידיס ו S. aureus צריך להיות מסוגל לגדול. המדיה היא דיפרנציאלית בין השניים כי S. aureus הוא מסוגל תסיסה מניטול - הפיכת מחוון מתיל אדום צהוב בהיר בשל הייצור של חומצה כמו תוצר לוואי תסיסה. S. epidermidis צריך לשמור על הצבע הוורוד על הצלחת.
הערה: אם המושבות קטנות, הצמיחה במדיום זה עשויה לדרוש דגירה נוספת למשך עד 48 שעות בטמפרטורה אופטימלית - כאן, 37 מעלות צלזיוס.
אאוזין מתילן כחול אגר (EMB):מדיום זה הוא סלקטיבי עבור אורגניזמים שליליים גרם, כך Escherichia coli ו לוחות פרוטאוס וולגאריס צריך להציג צמיחה. הצבעים הכחולים של אאוזין ומתילן רעילים לתאים חיוביים גרם ולכן אף מין סטרפטוקוקוס לא צריך לגדול. הממברנה החיצונית של תאים גרם שלילי מונעת הצבעים להיכנס לתאים. מדיה זו היא דיפרנציאלית כי זה מאפשר אחד לבדוק את היכולת של האורגניזם לתסוס לקטוז. E. coli הופך צבע סגול בהיר (לעתים קרובות עם ביהק מתכתי ירוק אם מעובד מספיק זמן) בשל תסיסה של לקטוז במדיה. P. וולגריס, למרות מסוגל לגדול, אינו תסיסה לקטוז (עם זאת הוא מסוגל לתסוס סוכרים אחרים).
אגר סויה טריפטי (TSA): המדיום הזה אינו סלקטיבי, כך שכל מיני המחקר צריכים לגדול. עם זאת, בהשוואה לתנאים האירוביים לעומת ה אנאירוביים, הלוחות מחבילת הגז צריכים להציג פחות צמיחה (ומושבות קטנות יותר). הסיבה לכך היא שאף אחד מהחיידקים הגדלים בהדגמה אינו חובה, אך מצב הצמיחה האופטימלי שלהם כולל חמצן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
מינים חיידקיים שונים מסוגלים לגדול בסביבות שונות ומסוגלים להשתמש במקורות פחמן שונים כדרך לייצר אנרגיה. כאשר עובדים עם אלה כתרביות במעבדה, חשוב לדעת את המרכיבים של מדיה הצמיחה להיות עבד עם ולהתאים את מדיה הצמיחה למין החיידקים. מדענים ומאבחנים יכולים גם לנצל את התגובות הביוכימיות השונות כדרך לבודד מינים שונים מאחרים וכדרך להבחין ולזהות חיידקים בסביבה מעורבת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Fernandez, L. A. Exploring prokaryotic diversity: there are other molecular worlds. Molecular Microbiology, 55 (1), 5-15 (2005).
- Grattieri, M., Suvira, M., Hasan, K., & Minteer, S. D. Halotolerant extremophile bacteria from the Great Salt Lake for recycling pollutants in microbial fuel cells. Journal of Power Sources, 356, 310-318 (2017).
- Wendt-Potthoff K. & Koschorreck, M. Functional Groups and Activities of Bacteria in a Highly Acidic Volcanic Mountain Stream and Lake in Patagonia, Argentina. Microbial Ecology, 1, 92 (2002).
- Lee, L. S., Goh, K. M., Chan, C. S., Annie Tan, G. Y., Yin, W.-F., Chong, C. S., & Chan, K.-G. Microbial diversity of thermophiles with biomass deconstruction potential in a foliage-rich hot spring. Microbiology Open, 7 (6), e00615 (2018)
- Ito, T., Sekizuka, T., Kishi, N., Yamashita, A., & Kuroda, M. Conventional culture methods with commercially available media unveil the presence of novel culturable bacteria. Gut Microbes, 10 (1), 77-91. (2019)
- Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., & Wade, W. G. Strategies for culture of "unculturable" bacteria. FEMS Microbiology Letters, 309 (1), 1-7. (2010)
- Harris, T. M., Rumaseb, A., Beissbarth, J., Barzi, F., Leach, A. J., & Smith-Vaughan, H. C. Culture of non-typeable Haemophilus influenzae from the nasopharynx: Not all media are equal. Journal of Microbiological Methods, 137, 3-5. (2017)
- Wang, Y.-Y., Ai, P., Hu, C.-X., & Zhang, Y.-L. Effects of various pretreatment methods of anaerobic mixed microflora on biohydrogen production and the fermentation pathway of glucose. International Journal of Hydrogen Energy, 36 (1), 390-396. (2011)
- Pascual, A., Basco, L. K., Baret, E., Amalvict, R., Travers, D., Rogier, C., & Pradines, B. Use of the atmospheric generators for capnophilic bacteria Genbag-CO2 for the evaluation of in vitro Plasmodium falciparum susceptibility to standard anti-malarial drugs. Malaria Journal, 10, 8 (2011).
- Summanen, P., McTeague, M., Väisänen, M.-L., Strong, C., & Finegold, S. Comparison of Recovery of Anaerobic Bacteria Using the Anoxomat®, Anaerobic Chamber, and GasPak®Jar Systems. Anaerobe, 5, 5-9. (1999)
- de la Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., & Hancock, R. E. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology, 16, 580-589. (2013)
- Possé, B., De Zutter, L., Heyndrickx, M., & Herman, L. Novel differential and confirmation plating media for Shiga toxin-producing Escherichia coli serotypes O26, O103, O111, O145 and sorbitol-positive and -negative O157. FEMS Microbiology Letters, 282 (1), 124-131. (2008)
