Overview
출처: 크리스토퍼 P. 코르보1,조나단 F. 블레이즈1,엘리자베스 수터1
1 생물과학부, 바그너 칼리지, 1 캠퍼스 로드, 스태튼 아일랜드 뉴욕, 10301
대핵 세포는 이 행성의 거의 모든 환경에 거주할 수 있습니다. 왕국으로서, 그들은 에너지 생성 (1)을 위해 분자의 다양한 사용할 수 있도록, 큰 신진 대사 다양성을 가지고. 따라서 실험실에서 이러한 유기체를 재배할 때 에너지를 만드는 데 필요한 모든 필요하고 구체적인 분자가 성장 매체에 제공되어야 합니다. 일부 유기체는 대사적으로 다양하지만, 다른 생물은 고온 또는 저온, 알칼리성 및 산성 pH, 감소 또는 산소 결석 환경 또는 높은 염(2,3,4)을 포함하는 환경과 같은 극단적인 환경에서 살아남을 수 있습니다. "극단적 인"이라고 불리는 이 유기체는 종종 이러한 강렬한 환경이 확산될 것을 요구합니다. 과학자들이 이러한 유기체를 성장시키고자 할 때, 미디어 구성 요소뿐만 아니라 특정 환경 조건은 모두 관심있는 유기체를 성공적으로 육성하기 위해 고려해야합니다.
과학자들은 그 종들이 성장해야 하는 특정 요구 사항을 이해하기 때문에 실험실에서 컬터류 유기체를 키울 수 있습니다. 그러나, 컬터류 유기체는 지구상에 있는 것으로 추정되는 종의 1% 미만을 차지합니다 (5). 유전자 시퀀싱에 의해 검출되었지만 실험실에서 성장할 수 없는 유기체는 헤비울 수 없는 것으로 간주됩니다(6). 이 때, 우리는 실험실에서 그들의 환경을 복제하기 위하여 이 유기체의 물질 대사 그리고 성장 조건에 관하여 충분히 모릅니다.
까다로운 유기체는 이전 둘 사이에 어딘가에 놓여 있습니다. 이 유기체는 culturable, 그러나 특정 성장 매체 분대 및/또는 특정 성장 조건과 같은 아주 특정 성장 조건을 요구합니다. 이러한 제네라의 두 가지 예는 Neisseria sp. 및 혈우병 스프., 둘 다 부분적으로 세분화 된 적혈구 (초콜릿 한천이라고도 함), 특정 성장 인자와 이산화탄소가 풍부한 환경 (7)을 필요로한다. 필요한 특정 구성 요소를 모두 사용하지 않으면 이러한 유기체는 전혀 성장하지 않습니다. 종종, 심지어 그들의 요구 사항의 모든, 이러한 유기체 가난한 성장.
유산소 또는 산소함유 산소에서만 자랄 수 있는 진핵세포와 달리, 환경, 원핵세포는 충분한 에너지를 생성하기 위해 여러 발효 경로를 사용하여 혐기성으로 성장할 수 있다(8). 다른 판핵생물은 마이크로에어로필릭, 또는 감소된 산소 환경, 또는 심지어 카노필릭, 또는 높은 이산화탄소 환경(9)을 선호한다. 이 유기체는 대기를 변경해야 하기 때문에, 풍부하게 하기 위하여 더 도전적입니다. 산소가 있는 환경에 민감한 유기체와 자주 작동하는 과학자들은 일반적으로 혐기성 챔버와 인큐베이터에서 작동하며, 아르곤과 같은 무겁고 불활성 가스가 산소(10)를 대체하기 위해 펌핑됩니다. 다른 사람들은 물을 사용하여 수소와 이산화탄소를 생성하는 기존의 밀봉 가스 패킷 시스템을 사용할 수 있으며 팔라듐과 같은 촉매와 함께 모든 대기 산소를 제거합니다. 이러한 시판되는 키트는 위에서 언급한 대기 조건(10)을 생성할 수 있습니다.
잠재적인 감염을 결정하기 위하여 병원체를 육성하거나 자연 환경에 존재하는 박테리아의 특정 종을 확인하기 위하여 찾고 있든, 1개의 문제가 있습니다. 아무도 세균성 종은 하나의 서식지에 거주하지 않습니다. 박테리아는 인간의 피부에서 지구의 바다에 이르기까지 사방에 다세포 공동체로 살고 있습니다 (11). 박테리아의 한 종을 격리하려고 할 때, 과학자는 또한 고립 된 지역에 살고있는 수많은 다른 유기체를 제외하기 위해 노력해야합니다. 이러한 이유로, 박테리아에 대 한 농축 된 성장 매체는 종종 두 가지 기능을 수행. 첫 번째는 미디어를 선택적으로 만드는 것입니다. 선택적 에이전트는 일부 종 성장 방지 할 것 이다, 억제 하지 않는 동안 종종 성장 하는 다른 사람을 촉진 (12). 미디어 성분의 두 번째 기능은 차동 제로 작용할 수 있다. 이러한 제제는 분리된 유기체의 특정 생화학적 특징을 식별할 수 있도록 허용한다. 몇몇 다른 선택적이고 차동적인 매체를 적당한 성장 조건과 결합해서, 과학자 및 진단자는 특정 격리에서 특정 세균종의 존재를 확인할 수 있습니다.
식별을 돕는 선택적 및 차동 매체의 한 예는 임상적으로 중요한 유기체 황색포도상구균의 경우이다. 이 유기체는 일반적으로 매니톨 소금 한천에 배양된다. 이 매체는 황색포도상구균과같은 일부 그램 양성을 포함하는 높은 소금 환경에서 살 수있는 유기체만을 선택할뿐만 아니라 소금에 민감한 유기체를 억제합니다. 매니톨 설탕은 이 매체의 차동 성분입니다. 모든 임상적으로 중요한 황색포도상구균 종 중, 오직 S. 아우레우스만이 매니톨을 발효시킬 수 있다. 이러한 발효 반응은 매체의 적색 메틸 적색 표시등이 노란색으로 변하는 부산물로 산을 생성합니다. 다른 황색포도상구균 종 (예 : 황색 포도상 구균 표피증)은성장 할 수 있지만, 색상의 미디어를 빨간색으로 남겨 둡니다.
이 실험실 운동은 적절한 무균 기술뿐만 아니라 국물에서 성장 미디어의 적절한 접종을 보여줍니다. 또한 농축 매체에 대한 일반적인 오염 물질의 성장, 혐기성 박테리아에 대한 가스 패키지 혐기성 배양 시스템의 사용, 그리고 그램 양성 및 그람 음성 박테리아의 추정 식별을 위한 다른 선택적 및 차동 매체의 사용을 소개합니다.
Procedure
1. 준비
- 시작하기 전에 손을 철저히 씻고 적절한 크기의 장갑을 착용하십시오.
- 5% 나트륨 하이포염(표백제)으로 작업 표면을 살균하고 철저히 건조시다.
- 작업 하는 동안 벤치 상단을 만지지 않도록 빈 120 mL Erlenmeyer 플라스크에 접종 루프를 배치합니다.
2. 성장 미디어 및 문화
- 냉장고에서 매니톨 소금 한천(MSA), 에오신 메틸렌 블루 한천(EMB), 8개의 트립틱 두유 한천(TSA)을 냉장고에서 4접시를 모으세요(상업적으로 구입할 수 있음).
- 청소된 작업 영역에 접시를 놓습니다.
- 다음 국물 문화를 수집 : 에셀리치아 대장균, 황색 포도상구균, 황색 포도상 구균 표피증, 프로테우스 저속한. 주의: 이 것들은 에어로빅 유기체이기 때문에, 관의 모자는 약간 느슨해야 합니다.
- 모든 문화를 청소된 작업 표면에 테스트 튜브 랙에 배치합니다.
3. 문화와 배양 의 양도
- 스탠드 또는 모든 재료가 닿는 벤치에 앉아 있습니다.
- 무균 기술을 사용하여 박테리아를 접시에 옮기려면 먼저 주황색이 빛질 때까지 루프를 불태우고 공중에서 식힙니다.
- 루프가 식는 동안, 대장균의국물 문화를 취한 다음 새끼 손가락을 사용하여 캡을 엽니다.
- 튜브의 개구부를 빠르게 화염으로 만드십시오. 이렇게 하면 오염이 방지됩니다.
- 루프를 튜브에 담그고 유기체를 EMB 플레이트의 첫 번째 사분면에 줄입니다.
- 첫 번째 줄무늬가 수행된 후 루프를 불태우고 첫 번째 줄무늬를 한 두 번만 통과하는 두 번째 줄무늬를 수행합니다. 이렇게 하면 단일 식민지 격리가 허용되고 오염이 있는지 확인할 수 있습니다.
- 판의 네 사분면이 모두 줄무늬가 될 때까지 이것을 반복합니다.
- 이제, 최종 생성물이 하나의 MSA 플레이트, 1개의 EMB 플레이트 및 유기체 당 2개의 별도 TSA 플레이트가 되도록 동일한 줄무늬 도금 방식으로 4개의 유기체의 나머지 각각을 전송합니다.
- 모든 유기체가 옮겨지면 루프를 마지막으로 화염에 태우고 버리게 됩니다.
- 각 유기체와 TSA 플레이트 1개를 가스 패킷에 넣은 다음 가스 봉지를 흔들어 플레이트와 함께 챔버에 넣습니다. 단단히 밀봉하십시오.
- 모든 플레이트를 하룻밤 사이에 37°C에서 배양합니다.
- 5% 표백제로 작업 표면을 마지막으로 살균합니다.
4. 결과 읽기 및 기록
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 깨끗한 실험실 벤치에 놓습니다.
- 실험실 노트북의 각 플레이트의 유기체의 성장에 유의하십시오. 특히 다음 사항에 대한 자세한 내용은 다음과 같은 사항을 자세히 설명합니다.
- 각 플레이트의 식민지 의 숫자와 크기 (존재하는 경우) 각 도금 변형에 대해
- MSA 플레이트에서 자라는 식민지를 둘러싼 한천의 출현
- EMB 플레이트에서 자라는 식민지의 출현
- 외부성장과 가스 패키지 내부의 TSA 플레이트 간의 성장 차이
박테리아는 사막 툰드라에서 열대 우림에 이르기까지 지구상의 거의 모든 환경에 거주할 수 있습니다. 크게 다른 틈새 시장을 식민지화하는이 능력은 그들의 적응력과 광대 한 신진 대사 다양성 에 기인, 에너지 생성을 위한 분자의 다양 한 활용 을 허용. 지구상에 있는 세균성 종의 1% 미만이 culturable로 간주되고 이들은 그들의 특정 신진 대사 및 환경 필요의 이해 때문에 만 가능하다는 현상에 이끌어 내는 다양성의 이 거대한 배열입니다.
실험실에서 미디어와 환경의 조작을 수행하면 연구자가 관심 있는 종을 배양하기 위한 최적의 조건을 찾기 위해 실험할 수 있게 해주지만, 혼합 배양에서 특정 종을 선택하는 조건을 변경하는 과정인 농축을 가능하게 합니다. 몇몇 미생물 종은 일반인이고 국가 또는 환경의 다양한 견딜 수 있습니다. 이러한 유기체는 실험실 조건하에서 쉽게 성장할 수 있지만, 극단적 인 서식지가 주어지면 성장하지 못할 수 있습니다 - 목표가이 조건에 관대 한 혼합 문화에서 유기체를 풍부하게하는 것이 목표인 경우 도움이 될 수 있습니다.
까다로운 유기체는 컬터럴수 있지만 특정 조건이 충족될 때만 가능합니다. Neisseria 또는 혈우병 종, 예를 들어, 부분적으로 적혈구와 높은 이산화탄소 농도를 포함하는 매체를 필요로, 이는 또한 다른 종의 성장을 낙담 할 수 있습니다. 극성 애호가들은 매우 낮거나 높은 온도, 감소 또는 산소 결석 조건 또는 높은 염분이 있는 경우와 같은 극한 조건에 대한 선호도에 따라 명명됩니다. 이 조건은 대부분의 그밖 세균에 참을 수 없습니다.
관심 있는 유기체에 대 한 더 풍부 하 게, 일부 미디어 유형 유기체의 물질 대사에 대 한 통찰력을 제공 하는 지표를 포함. 매니톨 소금 한가르는 높은 소금에 민감한 유기체의 성장을 억제합니다. 그램 부정적인 박테리아는 전형적으로 살아남을 수 없습니다, 그러나 그램 양성 황색포도상구균 속은 번창할 수 있습니다. 또한, MSA 천은 발효의 산 부산물이 매체의 메틸 적색 표시기를 밝은 노란색으로 바꾸기 때문에 매니톨을 발효시킬 수 있는 모든 식민지를 나타낸다. 이렇게 하면 종의 보다 구체적인 선택을 허용할 수 있습니다.
또 다른 일반적인 농축 매체인 Eosin Methylene Blue에는 그람 양성 유기체에 독성이 있는 에오신과 메틸렌 블루 염료가 포함되어 있습니다. 그것은 또한 이 접시에 유당과 박테리아를 포함 이 발효시킬 수 있는 이 발효는 pH 격려 염료 흡수를 낮추는 산을 생성합니다. 이 식민지는 많은 양의 안료를 차지하며 어둡고 금속적으로 나타납니다. 이 실험실에서, 당신은 그들의 발달을 관찰하기 전에 3개의 다른 미디어 조건에 걸쳐 그리고 그 때 유산소 대 혐기성 조건의 밑에 4개의 다른 시험 유기체를 성장할 것입니다.
실험을 시작하기 전에, 철저하게 손을 씻고 적절하게 크기의 실험실 장갑을 착용하기 전에 건조. 그런 다음 5 % 표백제로 작업 표면을 살균하여 철저히 닦아냅니다. 다음으로, 멸균 접종 루프를 가지고 벤치 표면에 닿지 않도록 빈 125 밀리리터 플라스크에 핸들다운을 배치합니다. 그런 다음 냉장고에서 매니톨 소금 한천 4판 또는 MSA, 에오신 메틸렌 블루 한천 4판, EMB, 8개의 트립틱 대두 아가르 또는 TSA, 플레이트를 수집합니다. TSA 매체는 두 가지 환경 조건에 사용될 비선택적 성장 매체입니다. 마지막으로, 튜브 랙에 관심의 문화를 수집합니다. 여기서, 대장균, 황색포도상구균, 황색포도상구균 표피, 프로테우스 저속한자가 재배됩니다.
먼저 공구를 살균하는 데 사용되는 분젠 버너를 가볍게 비추십시오. 그런 다음 MSA 플레이트 1개, EMB 플레이트 1개, TSA 플레이트 2개를 가까이 에 두는 경우 를 닫습니다. 그런 다음 세균 배양 중 하나를 선택합니다. 이 네 개의 판을 첫 번째 문화로 접종할 것입니다. 무료 손으로, 접종 루프를 들고 몇 초 동안 오렌지빛때까지 버너의 불꽃에 살균. 루프가 공중에서 식힙니다. 그런 다음 국물 배양 튜브를 열고 빠르게 개구부를 불태우십시오. 배양에 루프를 찍어 첫 번째 플레이트의 첫 번째 사분면에 유기체를 줄입니다. 그런 다음 화염이 루프를 다시 살균하고 두 번째 사분면을 줄입니다. 화염 살균의이 작업을 반복한 다음 세 번째 와 네 번째 사분면을 완료하기 위해 줄무늬. 이러한 방식으로 줄무늬는 고립 된 식민지를 제공하고 문화가 오염되지 않는다는 것을 확인해야합니다.
이제 뚜껑을 교체하고 접시의 바닥에 박테리아, 미디어 유형, 날짜 및 이셜의 이름으로 레이블을 지정합니다. 그런 다음, 매번 라벨을 붙이도록 주의하는 나머지 3개의 플레이트 각각에 대해 동일한 세균 배양을 사용하여 줄무늬 도금을 반복한다. 이제 첫 번째 문화가 줄무늬되었으므로 다른 박테리아가 각 종에 대해 접종된 MSA 플레이트 1개, EMB 플레이트 1개 및 TSA 플레이트 2개를 획득할 수 있는 이러한 단계를 반복합니다. 모든 유기체가 옮겨지면 루프를 마지막으로 화염으로 만드시면 됩니다.
감소된 산소 환경에서 성장할 수 있는 유기체를 결정하기 위해 밀봉된 가스실 시스템을 열고 TSA 박테리아 플레이트 4개 세트를 내부에 배치합니다. 그런 다음 혐기성 상태 봉지를 챔버에 넣고 단단히 밀봉하십시오. 마지막으로, 밀폐된 가스실 시스템 내부를 포함한 모든 플레이트를 하룻밤 사이에 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 앞으로, 매 24 ~ 48 시간 마다 플레이트를 확인 하 고 식민지 성장 하 고 어떤 지표 반응 물질을 대사 하는 시간을 제공.
다른 세균성 종들이 각 성장 상태에 얼마나 잘 반응하는지 평가하기 위하여는, 먼저 각 미디어 모형및 혐기성 대 호기성 조건에서 식민지를 생성할 수 있던 종을 가진 성장 및 기록을 위한 판을 검사합니다. 성장하는 유기체의 색상뿐만 아니라 식민지의 크기와 모양을 유의하십시오.
매니톨염 한천 배지는 6에서 살아남을 수 있는 그램 양성 유기체에 대해 선택적이다. 염화 나트륨 5% 이 실험에서, 이것은 그람 음성 대장균과 P. 저속한염이 높은 염농도 때문에 성장하지 않았다는 것을 의미했습니다. S. 표피와 S. 아우레우스는 성장할 수 있었다, 그러나, 그들은 그램 양성 임을 확인. 또한, S. 아우레우스가 발효의 산 부산물으로 인해 미디어의 메틸 적색 표시기를 밝은 노란색으로 돌리는 매니톨을 발효할 수 있기 때문에 두 종 사이에는 뚜렷한 차이가 있다. 이것은 S. 표피의경우 볼 수 없었다.
반면에 EMB 배지는 그람 음성 유기체에 대해 선택적이며, 이는 에오신과 메틸렌 블루 염료가 그램 양성 세포에 독성이 있기 때문이다. 그람 음성 박테리아의 외부 막은 세포에 들어가는 이러한 독성 염료를 방지, 그들은 성장할 수 있다는 것을 의미. 더욱이, 이 매체는 존재하는 세균성 종들이 유당을 발효할 수 있는지 여부를 나타낸다. 여기서 대장균 콜로니는 짙은 보라색으로 변하며 때로는 발효를 나타내는 녹색 금속 광택이 있습니다. P. 저속한이 배지에서 자라지만 유당을 발효시키지 않으므로 염료가 있는 것에서 보라색으로 밝은 분홍빛이 나타납니다. 혐기성 조건에서, TSA 미디어에 세균성 종은 여전히 성장해야하지만 충분한 산소를 가진 것과 비교하여 매우 가난하게 할 수 있습니다. 이것은 시험 종의 아무도 의무 혐기성 이기 때문에.
성장 환경을 풍요롭게 하기 위해 이와 같은 실험은 혼합 된 샘플에서 특정 종을 선호하고 격리하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그(것)들은 또한 실험실 조정에 있는 다른 세균성 종에 대한 최적 성장 조건을 결정하는 것을 도울 수 있습니다, 따라서 추가 연구를 원조.
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Results
매니톨 소금 한천 (MSA): 이 매체는 염화 나트륨 6.5%에서 살아남을 수 있는 그램 양성 유기체에 대해 선택적이다. 그람 음성 유기체 인 대장균과 프로테우스 저속한염은 염농도가 높기 때문에 이 매체에서 자랄 수 없어야 합니다. S. 표피미디스와 S. 아우레우스는 성장할 수 있어야 합니다. S. 아우레우스가 매니톨을 발효할 수 있기 때문에 매체는 둘 사이의 차등이다 - 발효 부산물로 산의 생산으로 인해 메틸 레드 인디케이터 밝은 노란색을 선회. S. 표피미드는 접시에 분홍색 색상을 유지해야합니다.
참고: 식민지가 작으면 이 매체의 성장은 최적의 온도에서 최대 48시간 동안 추가 배양을 요구할 수 있습니다- 여기, 37°C.
에오신 메틸렌 블루 에러 (EMB): 이 매체는 그램 음성 유기체에 대한 선택적, 그래서 대장균과 프로테우스 저속한 플레이트는 성장을 전시한다. 에신과 메틸렌 블루 염료는 그램 양성 세포에 독성이 있으므로 연쇄상 구균 종은 성장해서는 안됩니다. 그람 음성 세포의 외부 막은 염료가 세포에 유입되는 것을 방지합니다. 이 매체는 유기체가 유당을 발효하는 능력을 테스트할 수 있기 때문에 차동이다. 대장균은 미디어에서 유당의 발효로 인해 밝은 보라색 색상 (종종 녹색 금속 광택이 충분히 길어지면)을 집니다. P. 저속한,성장 할 수 있지만, 유당을 발효하지 않습니다 (그러나 그것은 다른 설탕을 발효 할 수 있습니다).
트립틱 콩 한천 (TSA): 이 매체는 비 선택적, 그래서 연구 종의 모든 성장 한다. 그러나, 혐기성 조건 대 호기성을 비교, 가스 패키지에서 플레이트는 적은 성장 (및 작은 식민지)를 표시한다. 이것은 데모에서 자란 박테리아중 어느 것도 에어로브를 의무화하지 않기 때문이지만 최적의 성장 상태에는 산소가 포함되어 있기 때문입니다.
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Applications and Summary
다른 세균성 종은 다른 환경에서 성장할 수 있고 에너지를 생성하는 방법으로 다른 탄소 원을 사용할 수 있습니다. 실험실에서 문화로 이러한 작업 할 때, 함께 작업 되는 성장 매체의 구성 요소를 알고 세균 성 종에 성장 매체를 일치 하는 것이 중요 하다. 과학자와 진단은 또한 다른 종에서 다른 종을 격리 하는 방법으로 그리고 혼합 된 환경에서 박테리아를 구별 하 고 식별 하는 방법으로 다양 한 생화학 반응을 활용할 수 있습니다.
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