Segnali di calcio giocano un ruolo chiave in molti processi cellulari tra cui l'espressione genica, la sopravvivenza e la differenziazione. Qui mostriamo come eseguire l'imaging di calcio con Fura-2 AM. Immagini di calcio è uno strumento prezioso per studiare la regolazione del calcio intracellulare in tempo reale e la sua regolamentazione delle cascate di segnalazione.
Abstract
Immagini di calcio è una tecnica comune che è utile per misurare i segnali di calcio in cellule in coltura. Tecniche di imaging del calcio usufruire di coloranti indicatore di calcio, che sono molecole organiche a base di Bapta che cambiano le loro proprietà spettrali in risposta al legame di ioni Ca2 +. Coloranti indicatore di calcio si dividono in due categorie, rapporto-metrica coloranti come il Fura-2 e Indo-1 e singola lunghezza d'onda coloranti come Fluo-4. Rapporto-metrica coloranti cambiare sia la loro eccitazione o il loro spettri di emissione, in risposta al calcio, permettendo la concentrazione di calcio intracellulare da determinare in base al rapporto di emissione di fluorescenza o eccitazione a lunghezze d'onda diverse. Il principale vantaggio di utilizzare il rapporto-metrico coloranti oltre sonde singola lunghezza d'onda è che il segnale rapporto è indipendente dalla concentrazione di colorante, l'intensità di illuminazione, e la lunghezza del percorso ottico che permette la concentrazione di calcio intracellulare da determinare in modo indipendente di questi manufatti. Uno degli indicatori di calcio più comune è Fura-2, che ha un picco di emissione a 505 nm e cambia il suo picco di eccitazione da 340 nm a 380 nm in risposta al calcio vincolanti. Qui si descrive l'uso di Fura-2 per misurare altezze calcio intracellulare nei neuroni e altre cellule eccitabili.
Protocol
Colture Cellulari Le cellule possono essere coltivate utilizzando tecniche consolidate, ma deve essere placcato sulla # 1 coprioggetto di vetro spalmato con un adesivo cellulare (come polilisina, polyornithine o laminina) per impedire alle cellule di distacco o in movimento durante gli esperimenti di imaging. Soluzioni Esperimenti di imaging del calcio può essere eseguito utilizzando una varietà di soluzioni fisiologiche tra cui terreni…
Discussion
In questa presentazione abbiamo superato tutti i passaggi per eseguire l'imaging di calcio con Fura-2 AM. Abbiamo utilizzato i neuroni corticali come modello, ma di imaging calcio può essere utilizzato per misurare intracellulari di calcio in tempo reale in una varietà di cellule. Nel fare questa procedura è importante utilizzare coprioggetto di vetro al posto della plastica, dal momento che la plastica è spesso fluorescente a lunghezze d'onda ultraviolette, il che rende difficile l'imaging. Inoltre, è importante pre-coat i…