Summary
Señales de calcio juegan un papel clave en muchos procesos celulares, incluyendo la expresión génica, la supervivencia y la diferenciación. Aquí se demuestra cómo realizar imágenes de calcio con Fura-2 AM. Imágenes de calcio es una herramienta valiosa para estudiar la regulación del calcio intracelular en tiempo real y su regulación de cascadas de señalización.
Abstract
Imágenes de calcio es una técnica común que es útil para medir las señales de calcio en las células cultivadas. Técnicas de imagen de calcio aprovechar de tintes indicadores de calcio, que son BAPTA basado en moléculas orgánicas que cambian sus propiedades espectrales en respuesta a la unión de los iones Ca2 +. Tintes de calcio indicador se dividen en dos categorías, métricas relación-a colorantes como la Fura-2 y el Indo-1 y de una sola longitud de onda de colorantes como la Fluo-4. Métricas relación de colorantes o bien cambiar su excitación o de sus espectros de emisión en respuesta al calcio, lo que permite la concentración de calcio intracelular que se determina a partir de la proporción de emisión de fluorescencia o de excitación a longitudes de onda distintas. La principal ventaja de utilizar métricas relación de tintes más sondas sola longitud de onda es que la señal de relación es independiente de la concentración de colorante, la intensidad de iluminación, y la longitud del camino óptico que permite la concentración de calcio intracelular que se determinará de manera independiente de estos artefactos. Uno de los indicadores de calcio más común es la Fura-2, que tiene un pico de emisión a 505 nm y los cambios de su nivel máximo de excitación de 340 nm a 380 nm en respuesta al calcio. A continuación se describe el uso de la Fura-2 para medir las elevaciones de calcio intracelular en las neuronas y otras células excitables.
Protocol
Cultivo de células
Las células pueden ser cultivadas mediante técnicas establecidas, pero debe ser chapada en # 1 cubreobjetos de vidrio recubierto con un adhesivo celular (como polilisina, poliornitina o laminina) para evitar que las células se desprenda o en movimiento durante los experimentos de imagen.
Soluciones
Experimentos de imagen de calcio se puede realizar utilizando una variedad de soluciones fisiológicas incluyendo medios de cultivo celular. Es importante, sin embargo, para asegurarse de que las soluciones están libres de rojo fenol, que aumenta en gran medida el fondo fluorescente. Usamos solución Tyrodes, que es fácil de hacer e imita el líquido cefalorraquídeo, y lo complementan con el 0,1% de albúmina sérica bovina. Usamos la despolarización con cloruro de potasio 60-90 mM para activar los canales de calcio voltaje cerrada y thapsigargin 1μM (1 mM de existencias en DMSO) o 2μM Ionomycin (1 mM de existencias en DMSO) para activar el almacenamiento CRAC canales operados. A menudo es conveniente para eliminar el calcio de la solución extracelular para mostrar que las elevaciones de calcio se deben a la entrada de calcio. Al retirar el calcio es necesario para mantener la concentración total de cationes divalentes (Mg 2 + y Ca 2 +) constante. Al sustituir el potasio de sodio es necesario para mantener el equilibrio osmótico.
Tyrodes soluciones:
| Bajos de potasio 2 mM Ca 2 + Tyrodes (mM) | Bajos de potasio 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | Alto de potasio 2 mM Ca 2 + Tyrodes (mM) | Alto de potasio 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| Glucosa | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
Ajustar el pH a 7,4 con NaOH
Carga de tinte de calcio Fura-2
Cargamos las células con acetoxi-metil-éster Fura-2 (Fura-2 AM), que se difunde a través de la membrana celular y es de-esterificados por esterasas celulares para producir Fura-2 libre de ácidos. Los parámetros exactos de Fura-2 de carga varía mucho de unos tipos de células. Recomendamos probar varias condiciones mediante la preparación de varias soluciones de carga que contiene una concentración de varios de Fura-2 furioso 1 a 4 M, incubando las células en la solución de carga para una variedad de tiempos de 15 minutos a 2 horas y pruebas de la carga a temperatura ambiente y a 37 grados. Un protocolo simplificado para las neuronas corticales es la siguiente:
- Primero, prepare el 1 mM Fura-02 a.m. acciones mediante la adición de 50μl de DMSO a un vial de 50 microgramos a disposición de Invitrogen. Es importante utilizar DMSO seco empacado en atmósfera de nitrógeno y es necesario para eliminar el DMSO con una aguja de punción en el tabique para evitar la hidratación del DMSO. Después de preparar la solución Fura-2 estoy mantener en un lugar seco y oscuro. Fura-2 AM en DMSO es estable a temperatura ambiente durante 24 horas y es estable a - 20 grados en un recipiente seco durante varios meses.
- Alícuota de 2 ml de medio de cultivo en un tubo cónico de 15 ml, calentar a 37 grados. y añadir 2μl de Fura-02 a.m. acciones para generar un 1μM Fura-02 a.m. solución. Vortex la solución vigorosamente durante 1 minuto.
- La transferencia de la solución de carga de una placa de cultivo de 35 mm de tejido y la transferencia de los cubreobjetos con las células en el plato.
- Incubar las neuronas a 37 grados durante 30 minutos en un lugar oscuro incubadora. El tiempo de incubación con precisión.
- Preparar un plato de 35 mm que contiene 2 ml de medio de cultivo de tejidos sin Fura-2 AM. Quitar los cubreobjetos de la solución de carga y el lugar en el nuevo plato.
- Montar el cubreobjetos sobre la cámara de imágenes. Quitar los cubreobjetos de la antena de 35 mm y rápido montaje en la cámara y asegúrese de que no se seque de las células. Usamos una cámara de imagen fabricado por Warner instrumentos que permite a un cubreobjetos de 10 mm que contiene las células para ser montado en la parte inferior y un cubreobjetos segundos para ser montado en la parte superior formando un sándwich. Los dos cubreobjetos se aseguran con grasa de vacío a la cámara y dos tubos a cada lado de la cámara permite la perfusión de soluciones a través de la cámara. La línea de entrada está conectada a una jeringa y la línea de salida está conectado a un pozo que se vacía por una línea de succión conectado a una trampa de vacío.
El microscopio
Nosotros usamos un invertido Nikon Eclipse TE2000-U microscopio equipado con una lámpara de arco de xenón (Sutter Instruments), una etapa automatizado (Ludl), una rueda de excitación filtro (Ludl), y un dispositivo de refrigeración de carga par (CCD) (Hamamatsu Orka II). El microscopio es controlado por un com Macintoshordenador con software Open Lab (Improvisación). Varios paquetes de software están disponibles para la imagen radiométrica. Para las imágenes que utilizamos 40, 60 o 100 veces Nikon Fluor objetivos de inmersión en aceite con un NA superior a 1,2.
Protocolo de imagen
- Calibrar la platina del microscopio.
- Carga Tyrodes solución en la línea de entrada, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas de aire.
- Conecte la cámara a las líneas de perfusión y la solución de perfusión Tyrodes través de la cámara de nuevo, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas en la cámara
- Coloque una gota de aceite en el objetivo, coloque la cámara sobre la platina del microscopio y se centran en las células con luz transmitida.
- Examinar la fluorescencia de las células con la iluminación a 340 y de 380 nm utilizando los oculares. Las células en reposo debe ser tenue y luminoso a 340 a 380. En general, las células no debe ser iluminado con luz UV durante más de 10 o 15 segundos y la intensidad de la luz de excitación se debe reducir con un filtro de densidad neutra para evitar que la fototoxicidad.
- Se examinan las células con la cámara y ajustar la ganancia y la exposición de la cámara, para generar una imagen que está cerca de la saturación (pero no saturado) cuando se ilumina a 380 nm y muy por debajo de la saturación cuando se ilumina a 340 nm. Mantener la exposición por debajo de 200 ms, si es posible. Una vez establecido, no cambia la ganancia de la cámara o la exposición a menos que el plan para modificar también el fondo, Rmin y RMax (ver más abajo).
- Recoger una imagen en cada longitud de onda y el uso de la región de interés (ROI) de herramientas para medir la intensidad de la experiencia en una variedad de lugares en las imágenes para cada longitud de onda.
- Promedio de los valores de fondo e introduzca los valores de fondo en los lugares apropiados en el programa de imágenes. El valor de fondo se restará de cada píxel en el campo.
- Se recoge una imagen de relación de la práctica y ajustar los valores de umbral para cada longitud de onda para generar una imagen de relación que incluye sólo las células y no el fondo y que no es ruidoso en la región cerca de los bordes de las células.
- Establecer el valor de la proporción mínima (Rmin) en alrededor de un 10% por debajo de la proporción más baja de toda célula en el campo.
- Establecer el RMax ser aproximadamente 12 veces la Rmin. No cambie la rmin o rmax, entre los experimentos que se va a comparar ya que hará que la comparación difícil. Rara vez cambiar la Rmin y Rmax valores en nuestra plataforma de imagen.
- Use la etapa automatizado para encontrar los campos que va a la imagen, y registrar la ubicación de cada campo usando el software. Por lo general, recoger cinco campos de visión durante un experimento. Los movimientos automáticos a una etapa de campo, recoge una relación de la imagen y pasa al siguiente campo.
- Configurar el intervalo de tiempo transcurrido para recoger imágenes de entre 0,1 y 10 segundos, aparte en función del tipo de señales que espera ver.
- Iniciar el experimento.
- Al probar el sistema de imágenes de calcio a menudo es útil usar estímulos como Tyrodes alto nivel de potasio (65 mM KCl) o ionomicina (2μM) que causa un aumento de calcio intracelular y calcio extracelular solución gratuita que (con los topes de calcio como EGTA y BAPTA ) que reducirán la concentración de calcio.
Análisis
Una vez que el experimento completo que se desea convertir el conjunto de imágenes de proporción en las mediciones de calcio lapso de tiempo para que las células o regiones de interés dentro de las células. Para ello:
- El uso de la herramienta de la región de interés (ROI) para definir las áreas de la imagen en la que desea medir el calcio. Por lo general, útil para tener al menos un retorno de la inversión que cubre el cuerpo celular de la célula. Al definir el rendimiento de la inversión, es útil para reproducir la película de las imágenes para comprobar que las células no se mueven durante el transcurso del experimento.
- Utilice el software para recopilar lapso de tiempo las mediciones para cada relación de retorno de la inversión en cada imagen.
- Importar la relación de las mediciones en un programa de análisis. Usted tendrá que ver las huellas de calcio de las células específicas o regiones de interés, el promedio de varias celdas o rendimiento de la inversión y convertir las medidas relación a los valores de calcio intracelular. Utilizamos un conjunto de macros escritas en Igor Pro que nos permite hacer todas estas tareas de análisis comunes, pero otros programas como Excel, aunque menos conveniente también se puede utilizar.
- La ecuación [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd se puede utilizar para convertir los valores de la relación Fura-2 a las concentraciones intracelulares de calcio. [Ca] es la concentración de calcio, R es la Fura-2 340/380 relación, Rmin y RMax son las relaciones de 340/380 en la ausencia de calcio o en la presencia de una concentración de saturación de calcio, respectivamente, y es de Sf * Kd el producto de la Kd del Fura-2 (aproximadamente 120 nm a temperatura ambiente) y un valor de escala. Para medir R Min, Max R y Sf * Kd que es necesario llevar a cabo ya sea in vivo o in vitro en la calibración. En la calibración in vivo requiere uncombinación de patch clamp y de imágenes de calcio, que puede ser complicado, pero es también muy precisa. En la calibración in vitro se puede hacer con una cámara casera de calibración que se compone de dos cubreobjetos separadas por un espaciador cubreobjetos delgada para generar una capa delgada de solución en la que para realizar la calibración. La forma más conveniente de medir la Fura-2 valores de la relación en función de las concentraciones de calcio es el uso de un kit de calibración que contienen múltiples soluciones tampón de calcio y Fura-2 libre de ácidos. Estos pueden ser obtenidos de Invitrogen (Molecular Probes) y contiene instrucciones precisas para su uso.
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Discussion
En esta presentación, hemos pasado por todos los pasos para la realización de imágenes de calcio con Fura-2 AM. Hemos utilizado las neuronas corticales como modelo, pero las imágenes de calcio puede ser usado para medir el calcio intracelular en tiempo real en una variedad de células. Cuando se realiza este procedimiento, es importante utilizar cubreobjetos de vidrio en lugar de plástico, ya que el plástico es a menudo fluorescente en longitudes de onda ultravioleta, lo que hace difícil de imágenes. Además, es importante que antes de cubrir el cubreobjetos con poliornitina y laminina con el fin de evitar que las células se desprenda. Por último, es importante tener en cuenta para evitar la creación de burbujas de aire cuando la perfusión de soluciones a través de la cámara de imágenes.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
