Summary
إشارات الكالسيوم يلعب دورا رئيسيا في العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك بقاء الجينات والتعبير والتمايز. نحن هنا لشرح كيفية القيام به Fura التصوير الكالسيوم ، 02:00. التصوير الكالسيوم هو أداة قيمة لدراسة تنظيم الكالسيوم داخل الخلايا في الوقت الحقيقي ولائحته التعاقب الإشارة.
Abstract
التصوير الكالسيوم هو تقنية مشتركة يمكن أن يكون مفيدا لقياس اشارات الكالسيوم في الخلايا المستزرعة. تقنيات التصوير الكالسيوم الاستفادة من الأصباغ مؤشر الكالسيوم ، والتي مقرها BAPTA الجزيئات العضوية التي تغير خصائصها الطيفية ردا على ربط أيونات + CA2. الأصباغ مؤشر الكالسيوم في فئتين ، ونسبة - متري الأصباغ مثل Fura - 2 - 1 والهندية وحيدة الطول الموجي مثل الأصباغ Fluo - 4. نسبة الأصباغ ، إما تغيير متري من الإثارة أو أطياف من الانبعاثات ردا على الكالسيوم ، مما يسمح تحديد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا من نسبة انبعاث مضان أو الإثارة في موجات مختلفة. والميزة الرئيسية لاستخدام نسبة - متري الأصباغ خلال تحقيقات الطول الموجي واحد هو أن نسبة إشارة مستقلة للتركيز الأصباغ ، وشدة الإضاءة ، والبصرية طول مسار السماح تحديد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا بشكل مستقل من هذه التحف. أحد المؤشرات الأكثر شيوعا هو الكالسيوم Fura - 2 ، التي لديها ذروة الانبعاثات في 505 نانومتر ، والتغييرات الإثارة ذروتها من 340 نانومتر إلى 380 نانومتر ردا على الكالسيوم ملزمة. نحن هنا وصف استخدام Fura - 2 لقياس الارتفاعات الكالسيوم في الخلايا العصبية والخلايا الأخرى منفعل.
Protocol
خلية ثقافة
يمكن زراعة الخلايا باستخدام تقنيات راسخة ولكن يجب أن يكون مطلي على # 1 coverslips الزجاج المطلي مع مادة لاصقة الخلوية (مثل polyornithine ، أو متعدد الليزين laminin) لمنع الخلايا من فصل أو نقل خلال تجارب التصوير.
الحلول
يمكن إجراء تجارب التصوير الكالسيوم باستخدام مجموعة متنوعة من الحلول بما فيها وسائط الثقافة الفسيولوجية الخلية. من المهم ، مع ذلك ، للتأكد من أن الحلول تكون خالية من الفينول الأحمر ، الذي يزيد كثيرا من الخلفية الفلورسنت. نستخدم Tyrodes حل ، والتي تتم بسهولة ويحاكي السائل النخاعي ، ونحن مع تكملة مصل الزلال البقري بنسبة 0.1 ٪. نستخدم الاستقطاب مع كلوريد البوتاسيوم 60-90 ملي الجهد لتنشيط قنوات الكالسيوم وبوابات Thapsigargin 1μM (1 ملم في الأسهم DMSO) أو 2μM Ionomycin (1 ملم في الأسهم DMSO) لتنشيط قنوات تخزين CRAC تشغلها. غالبا ما يكون مناسبة لإزالة الكالسيوم من الحل خارج الخلية لإظهار أن ترتفع الكالسيوم ومن المقرر أن تدفق الكالسيوم. عند إزالة الكالسيوم الضروري للحفاظ على التركيز الكلي للكاتيونات ثنائي التكافؤ (2 + المغنيسيوم والكالسيوم 2 +) ثابتة. عند استبدال البوتاسيوم الصوديوم لأنه من الضروري الحفاظ على التوازن التناضحي.
Tyrodes الحلول :
| انخفاض البوتاسيوم 2mm وكا 2 + Tyrodes (ملم) | انخفاض البوتاسيوم 0 كا 2 + Tyrodes (ملم) | ارتفاع البوتاسيوم 2mm وكا 2 + Tyrodes (ملم) | ارتفاع البوتاسيوم 0 كا 2 + Tyrodes (ملم) | |
| كلوريد الصوديوم | 129 | 129 | 5 | 5 |
| بوكل | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| جلوكوز | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم
تحميل صبغ الكالسيوم Fura - 2
نحن مع تحميل خلايا acetoxy ميثيل استر Fura - 2 (Fura ، 02:00) ، والذي ينتشر عبر غشاء الخلية ، واجتثاث أسترته بواسطة esterases الخلوية لانتاج حامض Fura - 2 مجانا. المعلمات الدقيق لFura - 2 تحميل تختلف على نطاق واسع عبر أنواع الخلايا. نوصي اختبار مختلف الظروف من خلال إعداد حلول التحميل عدة تحتوي على تركيزات متعددة من Fura - 2 مستعرة 1-4 ميكرومتر ، تفرخ الخلايا في حل تحميل لمجموعة متنوعة من الأوقات من 15 دقيقة الى 2 ساعة ، واختبار التحميل في درجة حرارة الغرفة و في 37 درجة. ويرد بروتوكول مبسط للعصبونات القشرية أدناه :
- أولا ، إعداد ملي 1 - Fura 2:00 الأسهم بإضافة 50μl من DMSO إلى قارورة 50μg المتاحة من Invitrogen. من المهم استخدام DMSO جافة معبأة تحت النيتروجين وأنه من الضروري لإزالة DMSO بإبرة بواسطة ثقب الحاجز لمنع الماء من DMSO. بعد إعداد الحل Fura AM - 2 يبقيه في مكان جاف ومظلم. Fura - 2 صباحا في DMSO غير مستقرة عند RT لمدة 24 ساعة ومستقرة في -- 20 درجة في حاوية جافة لعدة أشهر.
- قسامة 2 ملل من وسائل الإعلام الثقافة في أنبوب 15 مل المخروطية ، الحارة الى 37 درجة. وإضافة 2μl من Fura ، 02:00 المخزون لتوليد 1μM Fura ، 02:00 الحل. دوامة الحل بقوة لمدة 1 دقيقة.
- نقل حل التحميل لصحن 35 ملم زراعة الأنسجة ونقل ساترة مع الخلايا في الطبق.
- احتضان الخلايا العصبية في 37 درجة لمدة 30 دقيقة في حاضنة الظلام. الوقت حضانته بدقة.
- إعداد طبق يحتوي على 35 مم 2 ملل من وسائل الإعلام من دون زراعة الأنسجة ، Fura 02:00. إزالة ساترة من الحل التحميل ومكان في صحن جديد.
- تحميل ساترة على غرفة التصوير. إزالة ساترة من الطبق 35 ملم وتحميل بسرعة على غرفة مع التأكد من منع جفاف الخلايا. نستخدم غرفة التصوير آلات صنعت من قبل وارنر الذي يسمح لساترة 10MM تحتوي على خلايا لتركيبها على الجزء السفلي وساترة الثانية التي يتم تركيبها على القمة تشكيل لبيع الشطائر. يتم تأمين coverslips مع اثنين من الشحوم فراغ الى الغرفة ومواسير اثنان في طرفي الغرفة تسمح نضح من الحلول من خلال الغرفة. توصيل خط الإدخال إلى حقنة وتوصيل خط الانتاج الى البئر التي يتم تفريغها بواسطة خط الشفط متصلة فخ الفراغ.
المجهر
نستخدم مقلوب نيكون الكسوف TE2000 - U المجهر مجهزة مصباح قوس زينون (سوتر صكوك) ، وهي مرحلة الآلي (Ludl) ، وعجلة الإثارة تصفية (Ludl) ، وجهاز تبريد المسؤول عن زوجين (CCD) الكاميرا (هاماماتسو Orka الثاني). يتم التحكم بواسطة المجهر كوم ماكنتوشحاسوبية تشغيل البرمجيات مفتوحة مختبر (الارتجال). العديد من حزم البرامج الأخرى المتوفرة للتصوير ratiometric. التصوير نستخدم 40 ، 60 أو 100X النفط الأهداف فلور الغمر نيكون مع NA تتجاوز 1.2.
التصوير البروتوكول
- معايرة مرحلة المجهر.
- تحميل Tyrodes الحل في سطر الإدخال مع الحرص على منع تشكيل فقاعات الهواء.
- ربط الغرفة الى خطوط الارواء ويروي Tyrodes حل من خلال غرفة مرة أخرى ، مع الحرص على منع تكون الفقاعات في الغرفة
- وضع قطرة من الزيت على الهدف ، ومكان الغرفة على الساحة المجهر والتركيز على الخلايا باستخدام الضوء المرسل.
- فحص مضان من الخلايا باستخدام الإضاءة في 340 و 380 نانومتر في استخدام العدسات. وينبغي أن يستريح الخلايا خافت في 340 و 380 في مشرق. عموما ، يجب ألا تكون خلايا ضوئية للأشعة فوق البنفسجية لأكثر من 10 أو 15 ثانية ، وينبغي خفض كثافة الضوء الإثارة ذات الكثافة محايدة فلتر لمنع الضيائية.
- فحص الخلايا باستخدام الكاميرا ، وتعيين وكسب التعرض للكاميرا لتوليد الصورة التي هي قريبة من التشبع (ولكن ليس المشبعة) عندما يضاء في 380 نانومتر ، وأقل بكثير من التشبع عندما مضيئة في 340 نانومتر. إبقاء التعرض أدناه 200ms إذا أمكن ذلك. مجموعة مرة واحدة ، لا تتغير كسب الكاميرا أو التعرض إلا إذا كنت تخطط أيضا لتغيير الخلفية ، وRMin RMax (أنظر أدناه).
- جمع كل صورة في الطول الموجي واستخدام أداة منطقة (ROI) الفائدة لقياس كثافة الخلفية في مجموعة متنوعة من المواقع في صور لكل طول موجي.
- متوسط القيم الأساسية وإدخال القيم الأساسية في المواقع المناسبة في برنامج التصوير. سيتم خصم قيمة الخلفية من كل بكسل في هذا المجال.
- جمع صورة نسبة الممارسة وضبط القيم عتبة لكل طول موجي لتوليد صورة يتضمن فقط نسبة الخلايا وليس الخلفية ، وأنه ليس صاخبة في المنطقة على مقربة من حواف الخلايا.
- تعيين قيمة النسبة الأدنى (RMin) أن حوالي 10 ٪ أقل من أدنى نسبة من أي خلية في الميدان.
- تعيين RMax أن حوالي 12 أضعاف RMin. لا تغيير أو RMin RMax بين التجارب التي كنت تخطط للمقارنة لأنها سوف تجعل من الصعب المقارنة. نادرا ما نغير RMin والقيم Rmax على منصة التصوير لدينا.
- استخدام المرحلة الآلي للعثور على الحقول التي كنت تخطط لصورة ، وتسجيل موقع كل مجال استخدام البرمجيات. نجمعها عموما خمسة حقول من خلال عرض تجربة. التحركات المرحلة الآلي إلى حقل ، ويجمع صورة النسبة وينتقل إلى الحقل التالي.
- إعداد الفاصل الزمني الفاصل بين لجمع الصور بين 0.1 و 10 ثوان يتوقف بغض النظر عن نوع من الإشارات التي تتوقع أن ترى.
- بدء التجربة.
- عند اختبار نظام التصوير الكالسيوم غالبا ما يكون من المفيد استخدام المنبهات مثل البوتاسيوم tyrodes عالية (65 ملي بوكل) أو ionomycin (2μM) التي من شأنها أن تتسبب في ارتفاع الكالسيوم داخل الخلايا ، والكالسيوم حل خارج الخلية الحرة التي من شأنها (التي تحتوي على الكالسيوم مثل المخازن وEGTA BAPTA ) من شأنها أن تقلل من تركيز الكالسيوم.
تحليل
بمجرد اكتمال التجربة كنت تريد تحويل مجموعة من الصور في قياسات نسبة الكالسيوم الوقت الفاصل بين لخلايا فردية أو مناطق ذات الاهتمام داخل الخلايا. للقيام بذلك :
- استخدام أداة الفائدة من المنطقة (ROI) لتحديد مناطق من الصورة التي تريد لقياس الكالسيوم. هو عموما من المفيد أن يكون واحد على الأقل ROI الذي يغطي جسم الخلية للخلية. عند تحديد رويس ، من المفيد لتشغيل الفيلم من الصور للتحقق من أن الخلايا لا تتحرك أثناء التجربة.
- استخدام البرنامج لجمع قياسات نسبة مرور الزمن لكل عائد الاستثمار في كل صورة.
- استيراد قياسات نسبة إلى برنامج التحليل. سوف تحتاج لعرض آثار الكالسيوم لخلايا معينة أو رويس ، أو خلايا متعددة متوسط رويس وتحويل القياسات النسبة إلى داخل الخلايا قيم الكالسيوم. نحن نستخدم مجموعة من وحدات الماكرو المكتوبة في برو ايغور التي تسمح لنا للقيام بكل هذه المهام المشتركة ولكن تحليل برامج أخرى مثل Excel ، وإن كان يمكن أيضا أن تستخدم أقل ملاءمة.
- المعادلة [كا] = (RR دقيقة) / (R ماكس - R) يمكن استخدامها SF * دينار لتحويل القيم نسبة Fura - 2 لتركيزات الكالسيوم داخل الخلايا. [كا] هو تركيز الكالسيوم ، R هو Fura - 2 340/380 النسبة ، وRMin RMax هي نسب 340/380 في غياب الكالسيوم أو في وجود تركيز تشبع من الكالسيوم على التوالي ؛ وSF * دينار نتاج دينار من Fura - 2 (ما يقارب 120 نيوتن متر عند RT) وقيمة التحجيم. لقياس R مين ، وماكس R SF دينار * فمن الضروري لتنفيذ إما في الجسم الحي أو في المختبر المعايرة. في الجسم الحي يتطلب معايرةمزيج من لقط التصحيح والتصوير الكالسيوم الذي يمكن أن يكون معقدا ولكن أيضا دقيقة جدا. في المختبر يمكن أن تتم المعايرة باستخدام محلية الصنع غرفة المعايرة التي تتألف من اثنين من coverslips مفصولة هل ساترة رقيقة لتوليد طبقة رقيقة من الحل الذي لإجراء المعايرة. الطريقة الأكثر ملاءمة لقياس القيم Fura - 2 نسبة كدالة للتركيزات الكالسيوم هو استخدام طقم المعايرة التي تحتوي على الكالسيوم حلول متعددة معزولة وFura - 2 حامض الحرة. ويمكن الحصول على هذه من Invitrogen (المسابر الجزيئية) وتحتوي على تعليمات دقيقة للاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العرض لقد مررنا كافة الخطوات لتنفيذ التصوير باستخدام الكالسيوم Fura - 2 AM. استخدمنا العصبونات القشرية كنموذج ولكن يمكن استخدامها لقياس التصوير الكالسيوم الكالسيوم داخل الخلايا في الوقت الحقيقي في مجموعة متنوعة من الخلايا. عندما تفعل هذا الإجراء المهم لاستخدام الزجاج بدلا coverslips من البلاستيك ، حيث غالبا ما تكون من البلاستيك على موجات الأشعة فوق البنفسجية فلوري ، مما يجعل التصوير صعبا. أيضا ، من المهم في مرحلة ما قبل معطف coverslips مع polyornithine وlaminin من أجل منع الخلايا من فصل. أخيرا ، من المهم أن نتذكر أن تجنب خلق فقاعات الهواء عندما perfusing حلول من خلال غرفة التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
