Summary
Calcium-signalen spelen een belangrijke rol in vele cellulaire processen zoals genexpressie, overleving en differentiatie. Hier laten we zien hoe calcium beeldvorming met behulp van Fura-2 AM uit te voeren. Calcium beeldvorming is een waardevol instrument om de regulering van intracellulair calcium in real time en de regulering van de signaaltransductie cascades studie.
Abstract
Calcium beeldvorming is een veelgebruikte techniek die nuttig is voor het meten van calcium signalen in gekweekte cellen. Calcium beeldvormende technieken profiteren van calcium indicator kleurstoffen, die zijn BAPTA op basis van organische moleculen die hun spectrale eigenschappen veranderen als reactie op de binding van Ca2 + ionen. Calcium indicator kleurstoffen vallen in twee categorieën, ratio-metrische kleurstoffen zoals Fura-2 en Indo-1 en single-golflengte kleurstoffen zoals Fluo-4. Ratio-metrische kleurstoffen veranderen ofwel hun excitatie of hun emissie spectra in reactie op calcium, waardoor de concentratie van intracellulair calcium te worden bepaald uit de verhouding van de fluorescentie emissie of excitatie bij verschillende golflengten. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van ratio-metrische kleurstoffen meer dan enkele golflengte probes is dat de verhouding signaal is onafhankelijk van de kleurstof concentratie, lichtintensiteit, en optische weglengte waardoor de concentratie van intracellulair calcium onafhankelijk van deze artefacten worden bepaald. Een van de meest voorkomende calcium indicatoren is Fura-2, die een emissie piek bij 505 nm en verandert de excitatie piek van 340 nm tot 380 nm heeft in reactie op de calcium binding. Hier beschrijven we het gebruik van Fura-2 om intracellulair calcium verhoging te meten in de neuronen en andere exciteerbare cellen.
Protocol
Cel Cultuur
Cellen kunnen worden gekweekt met behulp van bestaande technieken, maar moet worden uitgeplaat op # 1 glas coverslips bedekt met een cellulaire lijm (zoals polylysine, polyornithine of laminine) om de cellen te voorkomen dat los of te verplaatsen tijdens de imaging experimenten.
Oplossingen
Calcium imaging experimenten kunnen worden uitgevoerd met behulp van een groot aantal fysiologische oplossingen, waaronder celcultuur media. Het is echter belangrijk om ervoor te zorgen dat de oplossingen zijn vrij van fenol rood, die sterk verhoogt de fluorescerende achtergrond. We maken gebruik van Tyrodes oplossing, die gemakkelijk wordt gemaakt en bootst cerebrospinale vloeistof, en we te vullen met 0,1% Bovine serumalbumine. We maken gebruik van depolarisatie met 60-90 mM kaliumchloride aan spanningsgevoelige calciumkanalen en 1 uM Thapsigargin (1 mM voorraad in DMSO) of 2μM ionomycine (1 mM voorraad in DMSO) te activeren om winkel uitgebaat CRAC kanalen te activeren. Het is vaak handig om calcium te verwijderen uit de extracellulaire oplossing aan te tonen dat calcium verhogingen zijn het gevolg van calcium influx. Bij het verwijderen van calcium is het nodig het handhaven van de totale concentratie van tweewaardige kationen (Mg 2 + en Ca 2 +) constant is. Bij vervanging van kalium voor natrium is het nodig het handhaven van de osmotische balans.
Tyrodes oplossingen:
| Lage Kalium 2 mM Ca 2 + Tyrodes (mM) | Lage Kalium 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | Hoog Kalium 2 mM Ca 2 + Tyrodes (mM) | Hoog Kalium 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| Glucose | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
Pas de pH op 7,4 met NaOH
Laden van Fura-2 calcium kleurstof
We load cellen met acetoxy-methyl-ester Fura-2 (Fura-2 AM), die diffundeert door het celmembraan en is de-veresterd door cellulaire esterasen tot Fura-2 vrij zuur opleveren. De precieze parameters voor Fura-2 laden variëren sterk tussen celtypen. We raden het testen van diverse omstandigheden door het opstellen van een aantal laad-en lossystemen met een veelvoud concentraties van Fura-2 woedende 1-4 uM, het incuberen van cellen in de laad-oplossing voor een verscheidenheid aan tijden van 15 minuten tot 2 uur en het testen van het laden op kamertemperatuur en bij 37 graden. Een vereenvoudigd protocol voor corticale neuronen wordt hieronder gegeven:
- De eerste, de voorbereiding van de 1 mM Fura-2 AM voorraad door het toevoegen van 50μl van DMSO om een flesje 50 microgram die beschikbaar zijn vanaf Invitrogen. Het is belangrijk om droge DMSO verpakt onder stikstof en het is noodzakelijk om de DMSO verwijderen met een naald door aanprikken van de septum om hydratatie van de DMSO te voorkomen. Na bereiding van de Fura-2 AM-oplossing bewaar deze op een donkere droge plaats. Fura-2 AM in DMSO is stabiel bij kamertemperatuur gedurende 24 uur en is stabiel bij - 20 graden in een droge container voor enkele maanden.
- Aliquot 2 ml van de cultuur media in een 15 ml conische buis, warm tot 37 graden. en voeg 2μl van Fura-2 AM voorraad aan een 1 uM Fura-2 AM-oplossing te genereren. Vortex de oplossing krachtig gedurende 1 minuut.
- Breng de oplossing voor het laden van een 35 mm weefselkweek schotel en giet het dekglaasje met de cellen in de schaal.
- Incubeer de neuronen op 37 graden gedurende 30 minuten in een donkere incubator. De incubatie tijd precies.
- Bereid een 35 mm schotel met 2 ml van weefselkweek media zonder Fura-2 AM. Verwijder het dekglaasje van de laad-oplossing in de nieuwe schotel.
- Monteer de dekglaasje op de beeldvorming kamer. Verwijder het dekglaasje van de 35 mm schaal en snel monteren op de kamer en zorg ervoor dat het drogen te voorkomen van de cellen. We maken gebruik van een imaging kamer vervaardigd door Warner Instruments, dat een 10 mm dekglaasje met daarin de cellen te worden gemonteerd op de bodem en een tweede dekglaasje te worden gemonteerd op de top de vorming van een sandwich maakt. De twee dekglaasjes zijn beveiligd met vacuüm vet naar de kamer en twee buizen aan weerszijden van de kamer zorgen voor perfusie van oplossingen door de kamer. De ingang is aangesloten op een spuit en de uitgang is aangesloten op een goed dat wordt geleegd door een zuigleiding aangesloten op een vacuüm te vangen.
De microscoop
We maken gebruik van een omgekeerde Nikon Eclipse TE2000-U microscoop uitgerust met een xenon-arc lamp (Sutter Instruments), een geautomatiseerd stadium (Ludl), een excitatiefilter wiel (Ludl), en een gekoeld Charge-Couple Device (CCD) camera (Hamamatsu Orka II). De microscoop wordt bestuurd door een Macintosh comcomputer draait Open Lab software (improvisatie). Diverse andere software pakketten zijn beschikbaar voor ratiometrische beeldvorming. Voor beeldvorming gebruiken we 40, 60 of 100x Nikon Fluor olie-immersie doelstellingen met een NA van meer dan 1,2.
Imaging Protocol
- Kalibreer de microscoop podium.
- Laad Tyrodes oplossing in de invoerregel en zorg ervoor dat de vorming van luchtbellen te voorkomen.
- Sluit de kamer om de perfusie lijnen en perfuseren Tyrodes oplossing door de kamer opnieuw, en zorg ervoor dat de vorming van bubbels in de kamer te voorkomen
- Plaats een druppel olie op de doelstelling, plaats van de kamer op de microscoop podium en richten zich op de cellen met behulp van doorvallend licht.
- Onderzoek de fluorescentie van de cellen met behulp van verlichting bij 340 en bij 380 nm met behulp van de oculairs. Rustende cellen moeten dimmen bij 340 en helder zijn op 380. In het algemeen moeten cellen niet worden verlicht met UV-licht voor meer dan 10 of 15 seconden en de intensiteit van het excitatie licht moet worden verminderd met een grijsfilter tot fototoxiciteit te voorkomen.
- Onderzoek de cellen met behulp van de camera en stel de gain en de belichting van de camera om een beeld dat dicht bij verzadiging (maar niet verzadigd) wanneer verlicht bij 380 nm en ver onder de verzadiging wanneer verlicht bij 340 nm te genereren. Houd de blootstelling beneden 200ms indien mogelijk. Eenmaal ingesteld, niet de camera te krijgen of de blootstelling te veranderen, tenzij je van plan bent om ook te veranderen op de achtergrond, Rmin en Rmax (zie hieronder).
- Verzamel een afbeelding op elke golflengte en gebruik de regio van belang (ROI) instrument om de intensiteit van de achtergrond te meten in een verscheidenheid van locaties in de beelden voor iedere golflengte.
- Het gemiddelde van de achtergrond op en vul de achtergrond waarden in de juiste locaties in het grafische programma. De achtergrond waarde wordt afgetrokken van elke pixel in het veld.
- Verzamel een praktijk verhouding beeld en pas de drempelwaarde vast voor elke golflengte een verhouding beeld dat alleen de cellen en niet de achtergrond en dat is niet luidruchtig in het gebied dicht bij de randen van de cellen onder te genereren.
- Stel de minimale verhouding tussen waarde (Rmin), op ongeveer 10% lager dan de laagste ratio van een willekeurige cel in het veld.
- Stel de Rmax worden ongeveer 12 keer de Rmin. Veranderen niet de Rmin of Rmax tussen experimenten die u van plan bent om te vergelijken omdat het maakt de vergelijking moeilijk. We zelden veranderen Rmin en Rmax waarden op onze beeldvorming rig.
- Gebruik de automatische podium om de velden die u van plan bent om beeld te vinden, en noteer de locatie van elk veld gebruik van de software. We verzamelen over het algemeen vijf gezichtsveld tijdens een experiment. De geautomatiseerde podium verhuist naar een veld, verzamelt een verhouding beeld en gaat verder met het volgende veld.
- Stel de time-lapse interval om beelden tussen 0,1 en 10 seconden van elkaar afhankelijk van het type van de signalen die je verwacht te zien te verzamelen.
- Start het experiment.
- Bij het testen van de calcium-imaging-systeem is het vaak nuttig om te gebruiken stimuli zoals hoge kalium tyrodes (65 mM KCl) of ionomycine (2μM), dat een intracellulaire calcium stijgen en calcium vrij extracellulaire oplossing zal leiden dat zal (met de calcium-buffers, zoals EGTA en BAPTA ), dat vermindert de calciumconcentratie.
Analyse
Zodra het experiment is afgerond wil je de set van de verhouding tussen beelden om te zetten in time-lapse calcium metingen voor de individuele cellen of gebieden van belang in de cellen. Om dit te doen:
- Gebruik maken van de regio van belang gereedschap (ROI) voor de gebieden van de afbeelding waarin u wilt calcium te meten te definiëren. Het is over het algemeen nuttig om ten minste een ROI dat het cellichaam van de cel omvat. Bij het bepalen van de ROI, is het nuttig om de film van de beelden om te controleren of de cellen niet bewegen in de loop van het experiment af te spelen.
- Gebruik de software om time-lapse-ratio metingen te verzamelen voor elke ROI in elk beeld.
- Importeer de verhouding tussen de metingen in een analyse programma. U moet het calcium sporen voor specifieke cellen of ROI, gemiddelde meerdere cellen of ROI's bekijken en de verhouding tussen de metingen om te zetten in calcium waarden intracellulaire. We maken gebruik van een reeks van macro's geschreven in Igor Pro die ons in staat om al deze gezamenlijke analyse taken, maar andere programma's zoals Excel te doen, maar minder handig kan ook worden gebruikt.
- De vergelijking [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd kan worden gebruikt om de Fura-2-ratio waarden om te zetten in calcium concentraties intracellulaire. [Ca] is de calciumconcentratie, R is de Fura-2 340/380 verhouding, Rmin en Rmax zijn de 340/380 ratio's in de afwezigheid van calcium of in de aanwezigheid van een verzadigende concentratie van calcium respectievelijk, en Sf * Kd is het product van de Kd van Fura-2 (ca. 120 nm bij RT) en een schaal waarde. Voor het meten van R Min, R Max en Sf * Kd is het noodzakelijk om zowel een in vivo of een in vitro kalibratie. In vivo kalibratie vereist eencombinatie van een patch klemmen en calcium beeldvorming, die kan worden gecompliceerd, maar is ook zeer nauwkeurig. In vitro kalibratie kan worden gedaan met behulp van een home-made kalibratie kamer die bestaat uit twee dekglaasjes van elkaar gescheiden door een dunne dekglaasje spacer om een dun laagje van de oplossing in om de kalibratie uit te voeren genereren. De meest handige manier om te meten Fura-2-ratio waarden als functie van de calcium-concentraties is het gebruik van een kalibratie-kit met meerdere gebufferde calcium-oplossingen en Fura-2 vrij zuur bevatten. Deze kan worden verkregen bij Invitrogen (Molecular Probes) en bevatten nauwkeurige instructies voor gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze presentatie hebben we doorlopen alle stappen voor het uitvoeren van calcium beeldvorming met behulp van Fura-2 AM. We corticale neuronen gebruikt als een model, maar calcium beeldvorming kan worden gebruikt om de intracellulaire calcium te meten in real-time in een verscheidenheid van cellen. Bij het doen van deze procedure is het belangrijk dat glas dekglaasjes gebruiken in plaats van plastic, want kunststof is vaak TL op ultraviolette golflengten, waardoor beeldvorming moeilijk. Ook is het belangrijk om vooraf de vacht van de dekglaasjes met polyornithine en laminine om te voorkomen dat cellen los. Tot slot is het belangrijk om te onthouden om te vermijden dat luchtbellen wanneer perfuseren oplossingen via de beeldvorming kamer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
