Summary
钙信号，发挥了关键作用，在许多细胞过程，包括基因表达，存活和分化。在这里，我们将演示如何执行使用FURA - 2的钙成像。钙成像是一种宝贵的的工具来研究细胞内钙离子的实时调控及其信号传导的调控。
Abstract
钙成像是一种常见的的技术，用于测量培养细胞中的钙信号。钙成像技术的优势，这是BAPTA为基础的有机分子，Ca2 +离子结合，改变其光谱特性的钙染料。钙染料分为两大类，如FURA - 2和Indo - 1和单波长染料如荧光4的比例度量的染料。比率度量染料改变他们的激发或发射光谱响应钙，使细胞内钙离子浓度在不同的波长的荧光发射或激发的比例确定。使用单波长探测器的比例度量的染料的主要优势是，信噪比是独立的染料浓度，光照强度，和光路长度，使细胞内钙离子的浓度，以确定这些文物的独立。最常见的钙指标之一是FURA - 2，它已经在505 nm处的发射峰从340 nm处的激发峰，380 nm的钙结合。在这里，我们描述了使用FURA - 2，在神经元和其他可兴奋细胞来衡量细胞内钙升高。
Protocol
细胞培养
细胞可以种植使用成熟的技术，但必须在1＃玻璃涂上与蜂窝胶粘剂（如聚赖氨酸，polyornithine或层粘连蛋白），以防止细胞分离或在移动成像实验盖玻片镀。
解决方案
可以使用各种生理的解决方案，包括细胞培养基钙成像实验。然而，重要的是，以确保该解决方案是无酚红，这大大增加了荧光背景。我们使用Tyrodes解决方案，这是很容易模仿脑脊液，和我们用0.1％的牛血清白蛋白的补充。我们使用60-90毫米氯化钾的去极化，激活电压门控性钙通道和1μM毒胡萝卜素（1 mM的股票在DMSO）或2μm的离子霉素（1 mM的股票在DMSO）激活商店经营的CRAC通道。它往往是方便，从细胞外液表明，钙的海拔是由于钙离子内流中删除的钙。消除钙时，要保持总浓度的二价阳离子（Mg 2 +和钙离子）的恒定。以钠钾时，有必要维持渗透压平衡。
Tyrodes解决方案：
| 低血钾2MM的Ca 2 + Tyrodes（毫米） | 低血钾的Ca 2 + Tyrodes（毫米） | 含钾高的2MM的Ca 2 + Tyrodes（毫米） | 含钾高的Ca 2 + Tyrodes（毫米） | |
| 氯化钠 | 129 | 129 | 5 | 5 |
| 氯化钾 | 5 | 5 | 129 | 129 |
| 氯化钙 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| 氯化镁 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| 血糖 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| HEPES | 25 | 25 | 25 | 25 |
用NaOH调整pH值至7.4
载入FURA - 2钙染料
我们的负载细胞与乙酰氧基甲基酯FURA - 2（FURA - 2 AM），扩散穿过细胞膜和细胞酯酶脱酯化收率FURA - 2游离酸。 FURA - 2装载的确切参数千差万别跨类型的细胞。我们建议测试各种条件准备几个加载解决方案，包含多FURA - 2浓度从1肆虐 - 4微米，在装载解决方案孵化的时间从15分钟到2小时，这和测试在室温下加载各种细胞和在37度。皮层神经元的一个简化的协议如下：
- 首先，准备加入二甲基亚砜50μL到50μg小瓶自Invitrogen FURA - 2上午股市在1毫米。重要的是在氮气包装用干二甲基亚砜，用针头刺破隔垫，以防止水化的二甲基亚砜二甲基亚砜有必要删除。 FURA - 2 AM解决方案后，准备在黑暗干燥的地方。 FURA - 2在DMSO稳定在室温下24小时，是在稳定 - 在几个月的干货集装箱20度。
- 分装2毫升到15毫升锥形管，温暖的37度文化传媒。并添加FURA - 22μLAM股票产生1μMFURA - 2上午的解决方案。旋涡的解决方案1分钟大力。
- 传输装载解决方案为35毫米组织培养皿中，并与细胞转移入菜的盖玻片。
- 孵育30分钟，在一个黑暗的孵化器在37度的神经元。正是时间的孵化。
- 准备好没有FURA - 2 35毫米的菜，含有2 MLS的组织文化传媒。删除加载的解决方案，并在新盘盖玻片。
- 安装成像室盖玻片。从35毫米盘取出盖玻片，并迅速安装到确保防止细胞干燥室。我们使用由华纳仪器制造成像室，包含要安装在底部，安装在顶部形成一个三明治第二盖玻片的细胞，可以让一个10mm盖玻片。两个盖玻片担保室两端允许灌注的解决方案，通过室，真空润滑脂，会议厅和两个管。输入线连接到一个注射器和输出线连接到一个掏空以及连接到真空陷阱吸线。
该显微镜
我们使用Eclipse的一个倒置的尼康TE2000 - U显微镜配有一个氙弧灯（萨特仪器），自动化阶段（Ludl），激发滤光片轮（Ludl），和一个冷却的电荷藕合器件（CCD）照相机（滨松Orka二）。显微镜是由一个Macintosh COMPUTER运行开放实验室软件（即兴）。其他几个软件包比例成像。成像，我们用40，60或100倍尼康福陆公司石油浸泡一个NA超过1.2目标。
成像协议
- 校准显微镜阶段。
- 负载Tyrodes照顾，以防止气泡的形成到输入行的解决方案。
- 将腔室灌注线，并通过灌注Tyrodes解决方案再次，照顾，以防止气泡的形成在会议厅内
- 客观上放置一个石油的下降，放置在显微镜舞台上腔和集中使用透射光的细胞。
- 检查的使用在340和380纳米，使用目镜照明细胞的荧光。在380应在340昏暗和明亮的休眠细胞。在一般情况下，细胞不应该被照亮超过10或15秒，与紫外线光激发光的强度应与中性密度过滤器，以防止光毒性减少。
- 检查使用相机的细胞，并设置增益和曝光的相机生成的图像是接近饱和（但不饱和）时远低于饱和时，在340 nm照射和照明在380 nm。保持200ms的下面如果有可能的暴露。一旦设置，不改变摄像机的增益或曝光，除非您打算改变背景，RMIN和Rmax（见下文）。
- 收集在每个波长的图像和使用区域的利息率（ROI）的工具来测量在不同的地点，在每个波长的图像背景的强度。
- 平均背景值和背景值进入成像程序的适当位置。背景值将减去在该领域的每一个像素。
- 收集了实践中的比例图像，并调整每个波长的阈值生成的比例图像，其中包括只有细胞，而不是背景，这不是在该地区靠近细胞的边缘嘈杂。
- 设置最低比率值（RMIN）在10％左右，低于最低的比例在该领域的任何单元格。
- 设置RMAX到12倍左右的RMIN。不要更改您计划比较，因为它会比较困难的实验之间的RMIN或RMAX。我们很少改变对我们的成像钻机RMIN和Rmax值。
- 使用自动化的阶段，找到您计划形象的领域，并记录每个字段的位置，使用该软件。在一项实验中，我们一般收取5个领域的观点。自动化的阶段移动到一个领域，收集的比例图像，并移动到下一个字段。
- 设置间隔时间推移，收集0.1和10秒之间除了取决于您期望看到的信号类型的图像。
- 开始实验。
- 钙成像系统测试时，它往往是有益的使用，如高的钾tyrodes（氯化钾65毫米）或离子霉素（2μm的）的刺激，将导致细胞内钙升高和无钙细胞外液（含EGTA和BAPTA钙缓冲区），这将减少钙离子浓度。
分析
一旦实验完成后，你将要转换成时间推移钙测量单个细胞或细胞内的感兴趣区域的比例图像。要做到这一点：
- 使用地区的利益工具（ROI）的形象在其中你要衡量钙定义的地区。它通常是有用的，至少有一个投资回报率，涵盖了细胞的细胞体。当确定的投资回报，这是有用的播放图像的影片，以验证该细胞在实验过程中不动。
- 使用该软件来收集时间推移，每幅图像中每个的投资回报率比测量。
- 导入比测量分析程序。您需要查看特定的细胞或投资回报率，平均多个单元格或投资回报的钙的痕迹和转换比率测量细胞内钙值。我们使用一套伊戈尔临写，使我们能够做所有这些常见的分析任务，但其他程序如Excel的宏，虽然不太方便，也可以使用。
- 方程[CA] =（RR 分钟 ）/（r 最高 - R）SF * KD可用于转换FURA - 2的比例值，细胞内钙离子浓度。 [CA]是钙离子浓度，R是FURA - 2三百八十○分之三百四比例，RMIN和Rmax中的钙缺乏或饱和浓度的钙存在三百八分之三百四十〇率分别; SF * KD FURA - 2 KD在室温（约120纳米）和定标值的产品。要测量，R R 最小最大和SF * Kd值它在体内或体外校准是有必要执行。需要在体内校准一个结合膜片钳和钙成像，它可以是复杂的，但也很精确。在体外校准可以使用自制的校准室，由薄盖玻片间隔分开的两个生成一层薄薄的解决方案，在其中进行校准的盖玻片组成。作为钙离子浓度的功能的测量FURA - 2的比例值，最方便的方式是使用校准套件包含多个缓冲钙的解决方案和FURA - 2游离酸。这些可从Invitrogen公司（分子探针），并包含使用精确的指示。
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Discussion
在此演示中，我们已经经历了使用FURA - 2上午进行钙成像的所有步骤。我们作为一个模型的皮层神经元，但可用于实时测量多种细胞的细胞内钙离子钙成像。当执行此过程，重要的是用盖玻片代替塑料，因为塑料是经常在荧光紫外线的波长，这使得成像困难。此外，重要的是预涂层与polyornithine和层粘连蛋白的盖玻片，以防止从分离的细胞。最后，重要的是要记住以避免产生气泡的解决方案，通过成像室时灌流。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
