Señales de calcio juegan un papel clave en muchos procesos celulares, incluyendo la expresión génica, la supervivencia y la diferenciación. Aquí se demuestra cómo realizar imágenes de calcio con Fura-2 AM. Imágenes de calcio es una herramienta valiosa para estudiar la regulación del calcio intracelular en tiempo real y su regulación de cascadas de señalización.
Abstract
Imágenes de calcio es una técnica común que es útil para medir las señales de calcio en las células cultivadas. Técnicas de imagen de calcio aprovechar de tintes indicadores de calcio, que son BAPTA basado en moléculas orgánicas que cambian sus propiedades espectrales en respuesta a la unión de los iones Ca2 +. Tintes de calcio indicador se dividen en dos categorías, métricas relación-a colorantes como la Fura-2 y el Indo-1 y de una sola longitud de onda de colorantes como la Fluo-4. Métricas relación de colorantes o bien cambiar su excitación o de sus espectros de emisión en respuesta al calcio, lo que permite la concentración de calcio intracelular que se determina a partir de la proporción de emisión de fluorescencia o de excitación a longitudes de onda distintas. La principal ventaja de utilizar métricas relación de tintes más sondas sola longitud de onda es que la señal de relación es independiente de la concentración de colorante, la intensidad de iluminación, y la longitud del camino óptico que permite la concentración de calcio intracelular que se determinará de manera independiente de estos artefactos. Uno de los indicadores de calcio más común es la Fura-2, que tiene un pico de emisión a 505 nm y los cambios de su nivel máximo de excitación de 340 nm a 380 nm en respuesta al calcio. A continuación se describe el uso de la Fura-2 para medir las elevaciones de calcio intracelular en las neuronas y otras células excitables.
Protocol
Cultivo de células Las células pueden ser cultivadas mediante técnicas establecidas, pero debe ser chapada en # 1 cubreobjetos de vidrio recubierto con un adhesivo celular (como polilisina, poliornitina o laminina) para evitar que las células se desprenda o en movimiento durante los experimentos de imagen. Soluciones Experimentos de imagen de calcio se puede realizar utilizando una variedad de soluciones fisiológicas incluyendo medio…
Discussion
En esta presentación, hemos pasado por todos los pasos para la realización de imágenes de calcio con Fura-2 AM. Hemos utilizado las neuronas corticales como modelo, pero las imágenes de calcio puede ser usado para medir el calcio intracelular en tiempo real en una variedad de células. Cuando se realiza este procedimiento, es importante utilizar cubreobjetos de vidrio en lugar de plástico, ya que el plástico es a menudo fluorescente en longitudes de onda ultravioleta, lo que hace difícil de imágenes. Además, es importante que antes…